甲狀腺激素對大鼠額葉乙酰膽堿的影響

劉俊霞，朱德發，王芬，王取南，馬維青

(1.安徽醫科大學第三附屬醫院內分泌科，合肥 230061;2.安徽醫科大學第一附屬醫院老年內分泌科;3.安徽醫科大學毒理實驗室)

甲狀腺功能減退癥(甲減)可引起認知功能損傷，包括記憶、注意、執行功能等方面［1］。乙酰膽堿(ACh)是中樞神經系統最重要的神經遞質之一，在腦內廣泛存在，與學習記憶密切相關。甲減導致乙酰膽堿含量變化的報道甚少，額葉是與學習記憶有關的關鍵腦區。因此，本研究將26只普通級健康成年期雄性SD大鼠分為甲減組、甲狀腺素替代治療組、健康對照組三組，采用含丙基硫氧嘧啶 (PTU)的自來水誘導建立甲減模型，以乙酰膽堿為指標，采用堿性羥胺比色法測定各組大鼠額葉內乙酰膽堿含量，探討甲減對額葉內乙酰膽堿的影響及替代治療效應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 普通級健康成年期雄性SD大鼠26只，體質量250～300 g，購自南京實驗動物中心。標準實驗條件下喂養，自然采光，所有大鼠自由進食、飲水。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 儀器 T3、T4、TSH采用放射免疫試劑盒(北方生物技術研究所)，檢測儀器為DFM-96型16管放射免疫γ計數器;－80℃冰箱;勻漿器;離心機;37℃恒溫箱;酶標儀(Biote，美國伯騰儀器有限公司);96孔板。

1.2.2 試劑 PTU、T4(Sigma公司);BCA Protein Assay Kit(Thermo公司);1.5 mmol/L毒扁豆堿(PSS);堿性羥胺(3.5 mol/L NaOH與2 mol/L鹽酸羥胺等量混合);1.84 mol/L三氯乙酸;0.37 mol/L FeC13，稱 三 氯 化 鐵 (AR，FeC13·6H2O)50g，加0.1 mol/L HCl至500m1，過濾后備用;標準貯存液(5 mg/m1):氯化乙酰膽堿62.15 mg或溴化乙酰膽堿77.34 mg(相當于 Ach 50 mg)，加 pH4.0鹽酸(0.1 mmol/L)至10 ml，分裝安瓶－20℃保存至少可用半年;標準應用液(Ach 0.5 mg/ml):將上液用蒸餾水稀釋10倍即得。

1.3 動物模型建立和標本制備 適應性喂養1周后，將大鼠隨機分為3組:健康對照組、甲減組、替代治療組。所有大鼠均喂養6周，對照組大鼠6周均每日飲用自來水;甲減組大鼠每日飲用含0.05%PTU的自來水6周;替代治療組大鼠每日飲用含0.05%PTU的自來水4周，第5周起開始腹腔注射左旋 T46 μg·kg－1·d－1。每周測體質量 1 次，根據體質量調整給藥劑量。實驗研究遵循“實驗用動物管理和使用指南”。

1.4 標本制備 待測 T3、T4、TSH的血清來源于腹主動脈血，腦標本來源于取血后在冰上迅速分離的腦組織，置于－80℃冰箱保存待測。

1.5 甲狀腺素水平測定 血清 T3、T4、TSH水平采用放射免疫法測定。

1.6 堿性羥胺比色法測腦組織內乙酰膽堿含量

1.6.1 乙酰膽堿測定步驟 采用堿性羥胺比色法［2］測定。斷頭后于冰臺迅速取大腦額葉部位組織，用精密電子稱重儀稱質量，按1∶9(每1克腦組織加9 ml0.9%氯化鈉溶液)用玻璃勻漿器制作成腦組織勻漿。(1)取腦組織勻漿0.2 ml加0.35 ml蒸餾水混合，再加 1.5 mmol/L 毒扁豆堿 0.05 ml，緩慢加入1.84 mol/L三氯乙酸0.2 ml充分混合，離心5000 r/min×5 min后取上清進行測定。設定4個管:測定管(A)、標準管(B)、對照管(C)、空白管(D)。(A):取腦組織上清100μl加入測定管，再加入堿性羥胺100μl，于室溫置15 min后依次加入4 mol/L HCl和0.37 mol/L三氯化鐵各50 ml;(B):標準管中依次加入標準應用液(乙酰膽堿0.5 mg/ml)10 μl、毒扁豆堿 10 μl、雙蒸水 55 μl、三氯乙酸(1.84 mol/L)25μl，再加入堿性羥胺100 μl，于室溫置15 min后依次加入4 mol/L HCl和0.37 mol/L三氯化鐵各50ml;(C):取腦組織上清100μl加入對照管，于室溫置15 min后依次加入0.37 mol/L 三氯化鐵 50 μl、4 mol/L HCl 50 ml、堿性羥胺100μl;(D):空白管中依次加入毒扁豆堿10 μl、雙蒸水65 μl、三氯乙酸(1.84 mol/L)25 μl，于室溫置15 min后依次加入0.37 mol/L三氯化鐵50 μl、4 mol/L HCl50ml、堿性羥胺 100 μl。以上各管每加入一個試劑均應充分振搖混勻。最后各管取200μl至96孔板中在酶標儀492 nm處比色。(2)BCA法測定腦組織蛋白含量:取腦組織勻漿200μl在4℃離心機15 000 r/15 min離心，取上清按BCA試劑盒說明書操作。

1.6.2 結果計算 (1)按照比色法公式計算:腦組織乙酰膽堿含量(μg/ml)=(A測定管－B對照管)/(C標準管－D空白管)×3.2/0.8×50

(2)每單位腦組織蛋白中所含乙酰膽堿(μg/mg)=比色法公式計算所得腦組織Ach含量(μg/ml)/蛋白含量(mg/ml)

2 結果

2.1 大鼠血清T3、T4、TSH水平 與健康對照組相比，甲減組大鼠血清 T3、T4水平顯著減低，TSH水平增高，差異有統計學意義;甲狀腺素替代治療后，血清T3、T4、TSH恢復至正常水平，差異無統計學意義，見表1。

2.2 三組大鼠額葉內乙酰膽堿含量 與健康對照組［(24.40±6.16)μg/mg］相比，甲減組大鼠額葉內乙酰膽堿含量［(17.59 ±2.70)μg/mg］減少，差異有統計學意義(P＜0.05)。替代治療后Ach含量［(19.34 ±4.42)μg/mg］恢復至正常水平，與健康對照組差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠血清 T3、T4、TSH水平()

表1 各組大鼠血清 T3、T4、TSH水平()

注:與健康對照組比較，a P＜0.05

組別 鼠數(只)T3(nmol/L) T4(nmol/L)TSH(μIU/ml)9 0.83 ±0.09 49.81 ±3.73 1.11 ±0.48甲減組 8 0.60 ±0.09a 18.19 ±5.70a 19.78 ±9.99a T4-6健康對照組9 0.83 ±0.25 52.42 ±6.06 1.21 ±1.01

3 討論

Ach是記憶、學習功能重要的神經遞質［3-4］，由膽堿和乙酰輔酶A為原料在膽堿乙酰移位酶(膽堿乙酰化酶ChAT)的催化下合成，以囊泡形式釋放，便被膽堿酯酶(AChE)水解為膽堿和乙酸。基底前腦膽堿能(CBF)神經元(主要位于基底核、斜角帶核和內側隔核)合成大量ACh并經膽堿能投射纖維輸送至大腦皮層。膽堿能投射功能的退變直接影響皮層的功能［5］，有人認為原發性癡呆，一個以腦部海馬早期損害逐漸延伸全腦的神經退行性疾病，存在嚴重的膽堿能系統功能退變，ChAT異常表達導致ACh合成障礙，使神經傳導缺乏必要的膽堿能遞質，從而影響學習和記憶［6］。另有研究發現［7］，以大腦損害為主的血管性癡呆患者也存在認知功能障礙，程度與ACh合成減少和 AChE活性相對增高、ChAT活性降低有關。

本實驗研究結果顯示，甲減組大鼠額葉內乙酰膽堿含量較健康對照組減少，有研究［8］發現成年期甲減大鼠腦組織內乙酰膽堿含量減少，與我們實驗結果一致。膽堿能神經元受損引起的腦組織ACh含量減少，可能是學習、記憶能力下降的重要病理學基礎，本實驗甲減大鼠Ach含量減少，提示腦內甲狀腺激素系統可能通過乙酰膽堿系統發揮對于學習記憶的調節作用。

給予甲減大鼠替代治療2周，甲減大鼠血清甲狀腺激素恢復至正常水平時，額葉內乙酰膽堿含量恢復正常。提示甲狀腺激素可以影響膽堿能系統，其具體機制不清，有報道認為甲狀腺激素影響Ach的代謝［9］。

本實驗提示成年期甲減大鼠額葉內乙酰膽堿含量較健康對照組降低，經替代治療能使乙酰膽堿含量恢復正常水平，提示甲狀腺激素與Ach及膽堿能神經通路有著密切的聯系，共同維持膽堿能神經系統的平衡，影響認知功能。

［1］時美琴，楊昊，朱德發，等.原發性甲狀腺功能減退癥對記憶功能的影響［J］.中國臨床保健雜志，2008，11(5):449－450.

［2］楊會宣，王文學，柯金水，等.堿性羥胺比色法測定全血乙酰膽堿［J］.臨床檢驗雜志，1995，13(3):125-129.

［3］DeNicola AF，Labombarda F，Deniselle MC，et al.Progesterone neuroprotection in traumatic CNS injury and motoneuron degeneration［J］.Front Neuroendocrinol，2009，30(2):173-187.

［4］Djebaili M，Guo Q，Pettus EH，et al.The neurosteroids progesterone and allopregnanolone reduce cell death，gliosis，and functional deficits after traumatic brain injury in rats［J］.J Neurotrauma ，2005，22(1):106-118.

［5］Ridley RM，Baker HF，Leowdyke A，et al.Further analysis of the effects of immunotoxic lesions of the basal nucleus of Meynert reveals substantial impairment on visual discrimination learning in monkeys［J］.Brain Res Bull，2005，65(5):433-442.

［6］耿勁松，周愛玲，胡亞娥，等.腦益康對阿爾茨海默病大鼠中樞膽堿能系統酶的影響［J］.時珍國醫國藥，2008，l9(7):1619-1621.

［7］Jia JP，Jia JM，Zhou WD，et al.Differential acetylcholine and choline concentrations in the cerebros pinalfluid of patients with Alzheimer’s disease and vascular dementia［J］.Chin Med J，2004，117(8):1161-1164.

［8］李永軍，王群，陸兵勛.成年甲減大鼠認知行為及其機制研究［J］.現代內科學雜志，2008，5(7):577-579.

［9］Smith JW，Evans AT，Costall B，et al.Thyroid hormones，brain function and cognition:a brief review［J］.Neurosci Biobehav Rev，2002，26(1):45-60.