養心顆粒含藥血清對豚鼠心室肌細胞外向延遲整流K電流的影響

張春芳，客蕊，孟濤，汪洋，周亞濱

(黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院急診科，哈爾濱 150040)

養心顆粒由《證治準繩》養心湯化裁而來，具有益氣養心安神的作用。臨床研究表明［1-4］，其不僅可降低心律失常的發生率，同時還可減少抗心律失常藥物的用量。動物實驗發現［5-8］，養心顆粒可改善家兔心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATP ase活性，通過阻斷心肌細胞Na+通道，抑制Na+離子過度內流，促進K+外流，使冠心病快速型心律失常出現時間延遲、持續時間縮短。但其對心臟鉀通道的影響尚未見報道。本實驗采用全細胞膜片鉗技術觀察養心顆粒含藥血清對心肌細胞動作電位(AP)及外向延遲整流K電流(Ik)的影響，探討其抗心律失常的相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雌性豚鼠40只，體質量250～350 g，由吉林大學實驗動物中心提供，許可證號碼為:SCXK-［吉］2003-t001。

1.2 藥物和試劑 養心顆粒:黃芪、茯神、半夏、當歸等十三味中藥，由黑龍江中醫藥大學制劑室制備成顆粒粉末，每克粉末含生藥量為6.2g。

HEPES、EGTA、Na2-ATP、小牛血清蛋白(BSA)、膠原酶Ⅱ等購自Sigma公司，臺氏液及細胞貯存液(KB)液試劑均為國產分析純。

1.3 儀器 CEZ-2400型膜片鉗放大器;Olympus倒置顯微鏡;ModelJD200-3精密電子天平;Narishige微電極拉制儀;Sakupa恒溫磁力攪拌器;Narishige三維操縱器;Narishige恒流泵;1200 series Interface數-模轉換器(美國);Langendorff灌流裝置。

1.4 溶液 分離心肌細胞和記錄動作電位所需溶液含 Ca2+臺式液:(mmol/ml):NaCl 143，KCl 5.4，CaCl2-2H2O 1.8，MgCl2-6H2O 0.5，NaH2PO4-2H2O 0.25，HEPES 5。用 NaOH 調PH值至7.4。無 Ca2+臺式液去掉上述臺式液配方中的Ca2+成分即可，其余成分均相同;KB液(mmol/ml):KOH 70，L-谷氨酸 50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO420，MgCl2-6H2O 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5，用 KOH 調 pH值至 7.4;灌流液(mmol/L):NaCl 143，KCl 5.4，MgCl20.5，CaCl21.8，NaH2PO40.25，HEPES 5，Glucose 10，用1 mol/L NaOH將pH調至7.4;電極內液(mmol/L):KCl 140，MgCl22，EGTA 2，CaCl21.8，HEPES 5，Na2-ATP 10，用1 mol/L KOH 將pH 調至7.2。實驗在室溫在22～24℃進行。記錄鉀通道Ik所需溶液:細胞外液(mmol/L):NaCl 140，KCl 5.4，MgCl2·6H2O 1.0，CaCl2·2H2O 1，CaCl2·2H2O 2.0，Glucose 10，TTX 0.03，HEPES 10，用 NaOH 調pH直至7.2～7.4(室溫29℃)。其中 TTX阻斷鈉通道，Cd2+阻斷鈣通道。電極液(mmol/L):potassi-um aspartate 80，KCl 42，KH2PO410，Mg2+-ATP 10，phosphocreatin 3，K+-EGTA 5，K+-HEPES 5，用 KOH調 pH 直至7.2 ～7.4(室溫29℃)。

1.5 方法

1.5.1 養心顆粒含藥血清制備 養心顆粒各組豚鼠每100克體質量灌2 ml藥液(7.54 g/kg)，每日給藥2次，早晚各1次，空白組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續給藥1周，于末次給藥后1 h心臟取血，于4℃靜置2 h后，低溫離心機離心，3500 r/min，離心15 min，將分離的血清同組混合，經56℃恒溫滅活30 min處理后，在超凈臺上用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，－20℃保存備用。

1.5.2 實驗分組［9-10］40只豚鼠隨機分為4組，空白對照組10只，給予普通細胞外液灌流;2%養心顆粒血清組10只，于普通細胞外液加入養心顆粒血清至其濃度達2%;4%養心顆粒血清組10只，于普通細胞外液加入養心顆粒血清至其濃度達4%;8%組養心顆粒血清組10只，于普通細胞外液加入養心顆粒血清至其濃度達8%。

1.5.3 心室肌細胞的分離［11］豚鼠經戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉后給予氣管插管，開胸做冠狀動脈插管，然后取心臟并固定于langendorff灌流架上，從主動脈逆向灌流含Ca2+臺式液2 min后，無Ca2+臺式液灌流5 min，最后用膠原酶 (15 mg/100 ml)的無Ca2+臺式液灌流10 min，從房室溝處剪下左心室放入細胞貯存液中，振蕩10 min(37℃)，吹打成單個心室肌細胞，置于KB液中，4℃冰箱中保存。灌流過程中持續通O2，灌流液溫度控制在37℃，灌流速度8 ml/min(室溫21℃)。

1.5.4 全細胞記錄單個心室肌細胞AP和外向延遲整流鉀離子流 選擇邊緣清楚、橫紋清晰的中等大小的心室肌細胞。微電極充灌電極液后，電阻為1～3 MΩ。將已加正壓的微電極緩緩插入浴液，直至接觸心肌細胞表面，持續負壓吸引。當電極尖端與細胞膜表面形成1～5GΩ封接電阻時，用力吸破電極尖端上的膜片，形成全細胞記錄。應用電流鉗方法，給予時程10 ms、1次/S、幅度為1～2 nA的電流脈沖，引導出豚鼠心室肌細胞的動作電位，并輸入計算機分析動作電位的幅度(APA)、靜息電位(RP)、Vmax、動作電位復極 50%、90% 時程(APD50、APD90)各項指標。穩定3 min后，分別以普通細胞外液或含2%、4%、8%養心顆粒血清的細胞外液灌流，10 min后再次觀察。在全細胞電壓鉗狀態下用鉀離子通道外液灌流10 min，穩定10 min后，以遞增方式以含養心顆粒血清2%、4%、8%的細胞外液灌流，每一細胞灌流2～3個濃度，再以正常電極外液沖洗10 min，記錄不同階躍電壓水平(從－50 mV到+50 mV，每次階躍命令為+10 mV，時程為400 ms)時的IK電流。為消除細胞間誤差，電流大小以電流密度(pA/pF)來表示。

1.5.5 數據的采集及分析 通過膜片鉗放大器記錄最大峰值的鉀電流，放大、濾波后數字信號，由Pclamp 6.03軟件控制，其數字化頻率為10 kHz，低通濾波器濾波頻率為3 kHz。

1.6 統計學處理 采用SPSS14.0軟件，所有實驗數據用表示，多組間比較用F檢驗，多組間兩兩比較用q檢驗。

2 結果

2.1 試藥血清對豚鼠心室肌細胞動作電位的影響

在分離的單個豚鼠心室肌細胞上，應用全細胞電流鉗的方式，引導出單個心室肌細胞的動作電位，測量動作電位的 Vmax、RP、APA、APD50和 APD90的參數。實驗中觀察了2%、4%、8%的養心顆粒含藥血清對豚鼠心室肌細胞動作電位的影響，見表1。

2.2 試藥血清對豚鼠心室肌細胞Ik的作用 在電壓鉗模式下記錄電流，為避免Ik出現隨時間而衰減的現象，所有記錄均在10 min內完成。將保持電位控制在－50 mV，檢測電位從 －50 mV到+50 mV，階躍命令為+10 mV，時程為400 ms。空白組Ik在－30 mV時被激活，最大外向峰值電流成分在+50 mV，其峰值電流為［(16.11 ±1.67)pA/pF，n=10］，電流對TEA敏感 (5μΜ)，電流成分被明顯抑制，表明電流成分對為對TEA敏感的鉀電流。Ik電流記錄穩定后，加入2%、4%和8%養心顆粒含藥血清灌流液，約2 min后，其峰值鉀電流分別為［(15.78±1.66)、(15.33 ±1.56)、(14.33 ±1.11)pA/pF，n=10］4%、8%含藥血清組明顯抑制Ik電流，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

表1 試藥血清對豚鼠心室肌細胞動作點位的作用()

表1 試藥血清對豚鼠心室肌細胞動作點位的作用()

注:與空白對照組比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01

組別 鼠數(只) APA(V/mV) Vmax RP(V/mV) APD50(t/ms) APD90(t/ms)±33.16 285.33 ±37.25 2%養心組 10 110.33 ±7.76 29.67 ±2.42 79.67 ±0.82 221.50 ±35.99 293.17 ±41.47 4%養心組 10 106.17 ±8.45 28.83 ±2.64 79.00 ±1.79 267.33 ±39.83a 341.50 ±42.60a 8%養心組 10 108.83 ±9.15 32.00 ±4.52 79.83 ±1.17 286.50 ±42.28b 356.33 ±26.43空白對照組 10 110.33 ±6.77 31.67 ±3.61 79.67 ±1.63 215.00 b

3 討論

心肌細胞動作電位的產生與心肌膜上的離子通道、離子流有密切關系，是細胞膜上多種離子通道順序開關綜合作用的結果。動作電位在不同的種屬之間存在差異，豚鼠的動作電位平臺期很長，比較容易研究藥物對動作電位時程的作用。適度延長APD對折返性心律失常的發生有抑制作用。但APD延長超過50%，易引起QT間期延長，則可能誘發早后除極及異常的觸發活動，是發生多形性室速的基礎。當靜息電位水平降低，0期去極化速度減慢，可引起傳導性下降，產生單向傳導阻滯或傳導減慢，兩者同時出現易致興奮折返發生，而引起快速性心律失常。因此，心肌傳導性降低也是發生心律失常的原因。

本實驗結果顯示，養心顆粒4%、8%組均能明顯延長豚鼠心室肌細胞動作電位時程APD50和APD90，以養心顆粒8%組影響更明顯，但也未超過35%，明顯低于致心律失常的值，養心顆粒2%組則無明顯影響。提示養心顆粒通過延長動作電位時程，使心室肌有效不應期延長，從而抑制折返性心律失常的形成，且可能有一定的濃度關系。養心顆粒各組對靜息電位、0期去極化速度無明顯影響。提示養心顆粒對心肌傳導性無明顯影響，不會引起心律失常。本實驗過程中也未發現致心律失常豚鼠。

動作電位時程是各種電流變化的綜合結果。既然動作電位時程有變化，必然存在離子電流的改變［12］。除了動作電位開始的0相去極化外，復極化(即1，2，3期)均與K+通道有關，Ik在復極2相激活，是平臺期的主要外向電流，對平臺期的時程起決定性作用;3相復極早期主要由Ik逐漸增強造成，3相復極晚期由Ik和少量Ik1的外向電流共同形成。Ik是調節豚鼠心室肌細胞復極化的主要離子流，對心室肌細胞動作電位2相平臺期的終止及3相復極化具有重要意義［13］，它的改變將直接影響心室肌動作電位時程的長短。

本實驗結果顯示，養心顆粒4%、8%組峰值鉀電流分別為 15.33 ±1.56、14.33 ±1.11，表現為電流密度—電壓曲線上移，對豚鼠心室肌Ik均有明顯的抑制作用，養心顆粒2%組則無明顯影響。提示養心顆粒通過抑制延遲整流 K+通道來延長ADP50、ADP90，從而延長有效不應期，發揮其抗心律失常的作用，且可能有一定的濃度依賴性。

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