結核分枝桿菌耐藥相關藥物外排抗原HLA-A2限制性細胞毒性T淋巴細胞表位預測*

陳 飛，高艷鋒，朱宇皇，祁元明

鄭州大學生物工程系鄭州450001

全球約有1/3的人口是結核的潛伏感染者，每年世界上有180萬人左右死于結核病［1］。耐藥結核分枝桿菌數量的日益增加是造成近年來結核病死灰復燃、卷土重來的重要原因［2］。結核分枝桿菌耐藥主要分天然耐藥機制和獲得性耐藥機制。獲得性耐藥主要是由于耐藥相關基因的點突變，而天然耐藥主要由于細胞壁的通透性障礙和活躍外排泵系統［3］。因此，藥物外排系統可以成為重要的耐藥結核治療靶點。近年來在動物模型及臨床研究［4］中發現，CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)在抗結核感染保護性應答中起著重要和獨特的作用。CD8+CTL對靶細胞發揮殺傷作用，必須能識別靶細胞表面與相應MHC-Ⅰ類分子結合的特異性抗原表位即CTL表位。目前研究的CD8+CTL表位主要集中在結核分枝桿菌特異的分泌蛋白上，如 ESAT-6、CFP-10、CFP-21、MPT64 及Ag85復合物等［5］，而對于膜蛋白尤其是藥物外排蛋白CD8+CTL表位報道很少，因此該研究主要針對結核藥物外排蛋白進行CTL表位預測。

1 材料與方法

1.1 資料來源 從NCBI網站獲取耐藥相關藥物外排 抗 原 (Rv1634、Rv2846c、Rv2937、Rv2686c、Rv2687c及 Rv3065)的氨基酸全長序列:Rv1634(NP_216150.1)，471 個氨基酸;Rv2846c(NP_217362.1)，530 個氨基酸;Rv2937(NP_217453.1)，289個氨基酸;Rv2686c(NP_217202.1)，252個氨基酸;Rv2687c(NP_217203.1)，237個氨基酸;Rv3065(YP_177922.1)，107 個氨基酸。

1.2 分析方法

1.2.1 BLAST分析 利用 Internet網絡進入 EXPASY 主頁(http://www.expasy.ch/tools/blast/)，選database(Human)，選定Identity BLAST，輸入各個蛋白的氨基酸序列后進行比對。

1.2.2 SYFPEITHI超基序法遠程預測CTL表位

預測由9個氨基酸殘基組成的CTL表位，具體方法:利用Internet網絡進入SYFPEITHI主頁(http://www.syfpeithi.de/)，選擇 Epitope-prediction 進入CTL表位預測界面。對Rv1634/Rv2846c/Rv2937/Rv2686c/Rv2687c/Rv3065的HLA-A*0201限制性CTL表位進行遠程預測，對分值較高的表位進一步進行分析。

1.2.3 BIMAS量化基序法預測分析 利用Internet網絡進入 BIMAS 主頁(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)，選定預測抗原肽長度(9)、CTL表位限制性MHC類型(HLA-A*0201)，將已獲得的抗原氨基酸全長輸入待預測序列框，運行遠程預測程序，獲得預測結果。

1.2.4 NetCTL預測分析 利用Internet網絡進入NetCTL 主 頁 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)，預測由9個氨基酸組成的CTL表位，選定supertype(A2)，閾值(0.75)，輸入氨基酸序列后進行在線預測。

2 結果

6個結核分枝桿菌耐藥相關藥物外排抗原與人類蛋白進行BLAST分析的結果見表1。

表1 結核分枝桿菌耐藥相關外排抗原與人類蛋白進行BLAST分析的結果

通過比較選擇共篩選出21個HLA-A2限制性CTL 優勢表位，分別為:Rv1634 54-62，170-178，184-192，248-256;Rv2846c 63-71，277-285，383-391，464-472;Rv2937 168-176，262-270，266-274，269-277;Rv2686c 74-82，151-159，181-189，184-192;Rv2687c 89-97，96-104，151-159;Rv3065 6-14，28-36(表2)。

表2 結核分枝桿菌外排抗原HLA-A2限制性CTL表位預測結果

3 討論

Bay等［6］發現，結核分枝桿菌H37Rv株Rv1634基因編碼一種假想的易化超家族(MFS)類外排泵Rv1634。當其在恥垢分枝桿菌過表達時，氟喹諾酮類藥物敏感性降低，呈現出低水平耐藥，提示這個外排泵與氟哌酸和環丙沙星外排有關。

EfpA(Rv2846c)是結核分枝桿菌H37Rv的外排泵蛋白，其二級結構與QacA轉運家族(細菌及酵母中調節抗抗生素和化學藥物抗性的蛋白家族)有很高相似性。從恥垢分枝桿菌基因組中克隆efpA基因，將之轉染恥垢分枝桿菌MC2155后，敲除efpA對氟喹諾酮、溴乙錠及吖錠黃敏感性提高［7］。

drrA、drrB可編碼ABC轉運體，其具有泵功能的結構是DrrA2B2。Pradhan等［8］證明，drrB 表達需要與上游drrA翻譯偶聯，用替代基因替代drrA，發現drrB表達過度，因此，兩者共同偶聯才會在耐藥機制中發揮作用。Rao等［9］研究發現，drrAB表達時恥垢分枝桿菌表現出對利福平、四環素、紅霉素等一系列結構不同的臨床常用抗生素耐藥。

Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c這3個基因是共同表達的。研究這3個基因完整的操縱子及分別研究每一個基因的耐藥情況及蛋白功能發現，過度表Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c的恥垢分枝桿菌MC2155，對環丙沙星高度耐藥;而僅Rv2686c過度表達時，對環丙沙星中度耐藥［10］。

Mmr在分枝桿菌的小耐多藥性家族(SMR家族)中。將結核分枝桿菌的mmr基因轉染至恥垢分枝桿菌MC2155，后者顯示出對紅霉素和溴乙錠等耐藥，而對利福平和鏈霉素等則無變化［7］。敲除mmr表現對氟喹諾酮、溴乙啶及吖啶黃敏感性提高，該耐藥表型由依賴能量的外排泵介導。微陣列分析發現mmr具有異煙肼、乙胺丁醇耐藥性［11］。

隨著生物信息學和互聯網數據庫的發展和積累，利用共享的專業表位預測數據庫，綜合分析結合力、結合半衰期、酶切位點等多項信息，成為當前表位預測主流方法。其基本理論依據為:某一特定類型的MHC-Ⅰ類分子可與多種不同的肽結合，但這些不同的抗原肽具有共同特點，即某些位置總是某一種或幾種具有相似側鏈或化學性質的氨基酸出現的頻率比較高，對肽與某一特定MHC-Ⅰ類分子之間的結合起決定作用。針對某一MHC-Ⅰ類分子和固定長度肽，可得出各種氨基酸殘基在各個位置的結合力評分，成為一個集合。目前已得到多種MHC-Ⅰ類分子的氨基酸結合力預測集合，構成了預測T細胞抗原表位的基礎［12］。

NetCTL是近年來發展起來的整合預測程序，它綜合了抗原肽提呈效率和酶切位點的打分，與目前公認的兩大預測程序SYFPEITHI和BIMAS形成很好的互補［13］。SYFPEITHI和BIMAS都是基于抗原肽與MHC-Ⅰ類結合特性而建立起來的方法，未考慮針對抗原加工處理過程的預測，因此將兩程序的預測結果再綜合NetCTL進行分析，實現兩類不同機制預測程序的有機結合，可以提高表位預測的準確率。聯合使用多種基于不同運算法則的預測軟件，可以減少傳統預測方式的大工作量而且縮短時間。但是這也存在不足，表位預測方式并不能100%的將所有的優勢表位都預測到，有些優勢表位會被漏掉。

綜上所述，盡管存在不足，這些表位仍有很大的可能是HLA-A2限制性CD8+CTL的優勢表位，篩選表位后通過進一步的CTL表位鑒定可為以后基于CTL表位肽的免疫治療及開發抗結核亞單位疫苗提供基礎。

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