美洲商陸抗病毒蛋白對人神經膠質瘤細胞U251細胞增殖和凋亡的影響

向 莉，李書劍 ，張杰文

河南省人民醫院神經內科鄭州450003

美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins，PAP)是在美洲商陸的不同組織或不同生長階段合成的一類具有酶功能的核糖體單鏈失活蛋白。該蛋白屬于Ⅰ型核糖體失活蛋白［1］，具有RNA N-糖苷酶的活性，能專一地從真核生物核糖體60S大亞基的28S rRNA特殊位點上切下一腺嘌呤，使其難以與蛋白質合成的延伸因子EF-2結合，從而阻礙蛋白質的合成［2-3］。最新研究［4-5］表明，PAP 不但能夠對7個植物病毒屬的成員具有抑制作用而且對真菌、細菌及人類免疫缺陷型病毒(HIV)等都具有一定的抑制效果。作者檢測了PAP對人神經膠質瘤細胞U251生長細胞周期分布及凋亡的影響，為進一步揭示PAP蛋白抑制腫瘤作用的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 PAP基因的克隆、重組及表達純化由鄭州大學公共衛生學院毒理學教研室完成。人神經膠質瘤細胞U251由鄭州大學公共衛生學院毒理學教研室傳代并保存。Taq DNA聚合酶購自北京鼎國公司。限制性內切酶、DNA Marker、dNTP、克隆載體pMD19-T Vector等購自 Takara公司。胎牛血清、RPMI 1640、2.5 g/L胰蛋白酶購自 Hyclone公司，MTT為Sigma公司產品。

1.2 MTT法檢測PAP對U251細胞生長的影響將U251細胞以每孔2×105個接種于96孔板中，培養 24 h 后換用含不同濃度 PAP(0、20、40、60、80和100 mg/L，處理48 h，實驗結束前4 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL繼續培養4 h，去上清液后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL/孔，振蕩 10 min;上酶聯免疫檢測儀，于波長492 nm處測每孔的吸光度(A)值。另取40 mg/L PAP處理U251細胞24、36、48和72 h，同上測定波長492 nm處的A值。細胞生長抑制率 =(1－A處理樣品/A對照樣品)×100%。每組設3個復孔。

1.3 流式細胞儀檢測各周期細胞百分比 在細胞培養板中每孔接種2×105個細胞，同時加入含40 mg/L PAP的培養液，在體積分數5%CO2培養箱中于37℃培養36 h(處理組)。以不加藥物的樣品孔為正常對照(對照組)。細胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，加入含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液終止消化并吹打成單細胞懸液。室溫500 g離心5 min收集細胞，用PBS洗滌細胞1次。細胞沉淀用體積分數70%乙醇(冰預冷)4℃固定24 h。離心去乙醇，用1 mL PBS重懸細胞后，過400目網篩，500 g離心5 min收集細胞。用0.2 mL PI染液懸浮細胞，4℃避光染色30 min，用流式細胞儀進行細胞計數與分析。細胞周期分析使用Pheonix公司的Multicycle軟件。

1.4 凋亡細胞觀察 40 mg/L PAP處理U251細胞36 h后，Hoechst33258染色，采用熒光顯微鏡觀察凋亡細胞核的形態，并計算凋亡細胞百分比。

1.5 Northern blot檢測FasL和Fas基因的表達取對數生長期的U251細胞分別以5×105個/瓶的密度接種于75 mL培養瓶，加入10 mL 0或40 mg/L PAP處理液，收集處理24、48、72和96 h的細胞，提取細胞總RNA，－70℃保存。比較42℃預雜交4 h，用［32P］dCTP 標記 FasL 和 Fas基因 cDNA 探針后42℃雜交20 h，洗膜后用X光片壓片3～7 d。β-actin作為內參。實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測FasL和Fas蛋白的表達將培養后的細胞用PBS沖洗，加入細胞裂解液提取細胞蛋白，離心收集上清液，用試劑盒測定蛋白濃度。每份樣品取40 μg進行120 g/L SDS-PAGE分析，濕式轉移法轉至膜，50 g/L脫脂奶粉封閉，加入一抗，4℃振蕩過夜，加入羊抗兔IgM作用2 h，采用化學發光法進行信號檢測。實驗重復3次。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0進行分析。應用單因素方差分析比較不同濃度或不同時間處理后U251細胞生長抑制率有無差異，兩兩比較用LSD-t檢驗，對照組和處理組細胞凋亡率比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 PAP對U251細胞生長的抑制作用 見表1和表2。

表1 不同濃度PAP處理48 h對U251細胞生長的抑制作用 %

表2 40 mg/L PAP處理不同時間對U251細胞生長的抑制作用 %

2.2 對照組和處理組各周期細胞百分比 見表3。

2.3 2組細胞凋亡情況 凋亡細胞皺縮，核密度增高，核斷裂，可見凋亡小體，細胞染色質呈濃染的塊狀或顆粒狀熒光，聚集于核周邊或裂解成碎片，見圖1。處理組細胞凋亡率(5.78±0.35)%高于對照組的(18.63 ±1.26)%(t=106.350，P=0.007)。

表3 對照組和處理組各周期細胞百分比 %

圖1 U251凋亡細胞核形態觀察(Hoechst33258，×100)

2.4 Northern blot和 Western blot檢測 U251 凋亡相關基因和蛋白的表達 Northern blot檢測結果顯示，40 mg/L的PAP處理后，隨處理時間的增加，Fas基因的表達受抑而FasL基因的表達上調(圖2A)。Western blot結果顯示，40 mg/L PAP處理后，隨著處理時間的增加，Fas蛋白的表達下降，FasL蛋白而有所增加(圖2B)。

圖2 FasL和Fas mRNA基因(A)和蛋白(B)的表達

3 討論

腫瘤細胞的凋亡是決定腫瘤生長快慢的主要因素之一。誘導腫瘤細胞凋亡是許多中、西藥抑制腫瘤機制之一。增強腫瘤細胞凋亡來促進其自然消退是治療腫瘤最有效的治療方法。

該研究發現PAP在體外20～100 mg/L濃度范圍內均能抑制U251細胞生長，且隨作用濃度增加，抑制作用增強，同時該研究還提示40 mg/L的PAP作用U251細胞后，隨作用時間增加，抑制作用增強。PAP處理U251細胞36 h可見典型的凋亡細胞形態學改變。流式細胞儀檢測結果也表明藥物PAP能誘導U251細胞凋亡，并且G0+G1期的U251細胞明顯增多，說明 PAP可以將U251細胞阻滯于G0+G1期。該實驗結果表明，PAP對人神經膠質瘤細胞株U251體外增殖具有明顯抑制作用，可能是通過誘導U251細胞凋亡實現的。研究［6-7］發現PAP能通過抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、提示其在抗腫瘤方面具有廣闊的應用前景。

該研究Northern blot和Western blot檢測結果顯示，PAP可抑制U251細胞Fas基因和蛋白的表達，上調FasL基因和蛋白的表達。Fas抗原及其配基(FasL)分別隸屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體和TNF超家族成員。由Fas與FasL結合啟動的凋亡信號傳導是最終導致細胞凋亡和(或)細胞毒效應的重要途徑。因此，對Fas/FasL途徑的深入研究可為通過誘導細胞凋亡而治療惡性腫瘤提供新的凋亡激發環節。

以上結果表明PAP蛋白能抑制U251細胞增殖，誘導人U251細胞發生凋亡，為PAP蛋白的開發和臨床應用提供了有力的依據。

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