口腔鱗狀細胞癌組織的拉曼光譜觀察

付 莉，刁振琦，劉健峰，饒鳳飛，張建民，唐偉躍#

1)鄭州鐵路職業技術學院醫學基礎部病理學教研室 鄭州450052 2)鄭州大學物理工程學院基礎物理教學中心 鄭州450001

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是發生在口腔黏膜最常見的惡性腫瘤，位居全身惡性腫瘤發病率的前10位，約占頭頸部惡性腫瘤的40%［1］，是威脅人類健康的主要疾病之一。目前患者治療后的生存率無明顯改善，術后轉移和復發是死亡的主要原因，根本原因在于早期診斷方法匱乏，錯失了治療的最佳時機［2］。拉曼光譜是一種簡便靈敏的光譜分析新技術，可以在分子水平上揭示癌細胞組織結構與正常細胞組織結構之間的差異，通過癌變組織和正常器官組織拉曼光譜的對比研究，發現反映改變的特征標志光譜。近年來拉曼光譜技術在細胞的結構、功能及細胞凋亡等方面的研究取得了迅速發展，它還能在一定程度上反映細胞內部蛋白質、核酸、脂類以及碳水化合物的成分、構象和含量變化［3］，從而使其在早期癌癥診斷中發揮重要作用。作者利用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀對口腔正常黏膜組織和OSCC組織標本進行測定，以期發現正?？谇火つそM織、OSCC組織的拉曼光譜在散射強度和譜線位置上存在的差異，為應用拉曼光譜技術早期診斷口腔黏膜惡性病變奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 標本來源 32例OSCC組織標本取自鄭州大學第一和第五附屬醫院2008年1月至2009年12月的手術切除標本，10例正?？谇火つそM織標本取自同期鄭州市口腔醫院的正?？谇火つそM織的標本，均知情同意。其中男3例，女7例，年齡39～64歲，中位年齡49歲。全部42例病例術前均無放化療及其他治療史。32例OSCC均經病理證實，其中男19例，女13例，年齡21～80歲，中位年齡56歲;原發部位:舌12例，頰10例，牙齦6例，口底4例;18例有深層浸潤(肌層、骨質或深層腺體)，14例有淺層浸潤(黏膜及黏膜下層);組織學分級:Ⅰ級21例，Ⅱ級11例。

1.2 拉曼光譜儀檢測 標本放入－22℃恒冷箱中迅速冷凍2 min，置于切片機做冰凍切片，厚1.0 mm，切出的組織切片直接附貼于清洗過的載玻片上，做好標記，晾干后置于激光共聚焦顯微拉曼光譜儀下進行光譜采集。激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(英國Renishaw公司生產)參數設定:激發波長514 nm，光譜掃描范圍500～2 000 cm－1，掃描時間20 s，采集次數1次。測試條件為室溫，相對濕度(40±5)%。

1.3 觀測指標 觀察經mathlab2009處理后典型的拉曼譜圖。對拉曼特征峰進行譜帶指認，分別歸屬如下:1 085 cm－1附近屬于核酸中磷酸基團的振動峰;1 134 cm－1附近為蛋白質 C=C伸縮振動;1 294 cm－1附近為蛋白質酰胺Ⅱ的C-O鍵伸縮振動;1 417和1 438 cm－1附近為CH2剪裁振動;1 459 cm－1附近為 C-H 彎曲振動［4］。

2 結果

正常口腔黏膜組織和OSCC組織切片600～2 000 cm－1波段內的吸收峰主要集中在1 000～1 600 cm－1范圍內，拉曼光譜圖見圖1。正?？谇火つそM織和OSCC組織切片的拉曼光譜譜帶頻移比較見表1。

圖1 2種組織的拉曼光譜圖

表1 2種組織切片的拉曼光譜頻移比較 cm－1

3 討論

正常組織與癌變組織的譜圖在峰頻移和峰強度方面表現出了差異性［5］，體現了在癌變組織中細胞形態和組織結構發生的變化，該研究結果顯示，譜圖的差別主要為:①口腔正常黏膜組織和OSCC組織切片的拉曼光譜相對強度存在差異，癌細胞胞核大，有時還會出現雙核或多核，因此對應的拉曼光譜相對強度強。②口腔正常黏膜組織1 085 cm－1的拉曼峰，在OSCC組織中發生4 cm－1的藍移，說明磷酸基團在癌變的變化過程中遭到破壞，此頻移較大，可以作為鑒別口腔正常黏膜組織和OSCC組織的重要依據。在對其他腫瘤組織的拉曼光譜研究［6］中也發現該譜帶有向高波數移動的現象。②正常黏膜組織的1 134 cm－1峰，在 OSCC組織中發生2 cm－1的藍移，可能與組織在癌變過程中C=C鍵的張力發生改變有關［7］。④口腔正常黏膜組織歸屬于蛋白質酰胺Ⅱ的C-O鍵伸縮振動的1 294 cm－1峰，在癌變組織中移動到了1 296 cm－1;1 417 cm－1的CH2剪裁振動在OSCC組織的切片中移動到了1 419 cm－1附近。說明癌變組織在一定程度上改變了該成分的結構［8］，癌變組織的核酸和蛋白質均發生了變化。從而導致癌變組織不同于正常黏膜組織的拉曼譜線。⑤正常黏膜組織和OSCC組織切片的拉曼峰1 438和1 459 cm－1均沒有產生頻移，能否讓其為拉曼譜的內標與其他各譜線相對強度和譜線位置做對比，找出相應的規律，有待進一步研究。

口腔正常黏膜組織和OSCC組織切片拉曼譜圖的這些變化表明組織細胞在癌變過程中，其構型、構象和數量上發生了變化;磷酸基團在癌變的變化過程中遭到破壞;C=C鍵的張力發生改變;核酸和蛋白質均發生了變化。以上結果表明激光顯微拉曼光譜法在揭示OSCC組織的發生、發展規律及其診斷的基礎研究中有著良好的前景。

［1］邱蔚六.口腔頜面外科學［M］.3版.北京:人民衛生出版社，1995:259

［2］李一，文志寧，李龍江，等.口腔鱗狀細胞癌近紅外拉曼光譜特征及其診斷價值研究［J］.華西口腔醫學雜志，2010，28(1):61

［3］齊健，郭鄭元，張廣水，等.利用拉曼光譜研究60Co γ射線對EC9706細胞的輻射損傷［J］.光譜學與光譜分析，2009，29(7):1896

［4］唐偉躍，劉婉華，孫雷明，等.肺癌切片的拉曼光譜分析［J］.激光雜志，2007，28(3):91

［5］張廣水，陳長青，齊健，等.EC9706細胞經不同劑量X射線輻照后的拉曼光譜［J］.中國激光，2009，36(2):509

［6］佟倜，葉松，安利民，等.鱗癌及其癌旁組織的共聚焦激光拉曼光譜分析［J］.吉林大學學報:醫學版，2004，30(5):813

［7］Kah JC，Kho KW，Lee CG，et al.Early diagnosis of oral cancer based on the surface plasmon resonance of gold nanoparticles［J］.Int J Nanomedicine，2007，2(4):785

［8］Oliveira AP，Bitar RA，Silveira L，et al.Near-infrared Raman spectroscopy for oral carcinoma diagnosis［J］.Photomed Laser Surg，2006，24(3):348