拉米夫定對慢性乙型肝炎患者CD28表達的影響

涂遠航，馬 勇，谷 旻

1)解放軍第123醫院肝病中心 蚌埠233015 2)解放軍第123醫院檢驗科蚌埠233015

慢性乙型肝炎(CHB)的治療，抗病毒是關鍵。但CHB患者對抗病毒藥物的反應差異較大。目前普遍認為，T淋巴細胞介導的細胞免疫對乙型肝炎病毒(HBV)的清除起關鍵作用，T淋巴細胞表面協同刺激分子及其配體的正常表達是其活化和發揮功能的關鍵因素。目前關于CD28在乙型肝炎免疫耐受中的作用研究［1-2］較多，但CD28的表達與抗病毒療效之間的關系，國內外鮮見報道。該研究檢測了CHB患者外周血T淋巴細胞CD28的表達，以分析其表達與抗病毒療效的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 42例CHB患者均為解放軍第123醫院肝病中心2006年5月至2010年6月收治的住院患者，男36例，女6例;年齡15～54(30±10)歲。所有病例均符合文獻［3］的診斷標準。所有病例均排除HBV相關性疾病，合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染者及自身免疫相關疾病者。入選前均未接受過抗病毒治療和免疫治療。入選后均給予拉米夫定片100 mg口服，1次/d，療程3 a，治療期間定期監測ALT、AST、膽紅素、白蛋白，以及病毒學標志包括HBeAg、抗-HBe和HBV DNA等。根據治療后的應答情況，分為完全應答組、部分應答組和無應答組［3］。完全應答組(n=11):HBeAg陽性 CHB患者，治療后 ALT恢復正常，HBV DNA檢測不出(PCR法)和HBeAg血清學轉換;HBeAg陰性CHB患者，治療后ALT恢復正常，HBV DNA檢測不出(PCR法)。部分應答組(n=21):介于完全應答與無應答之間。如HBeAg陽性CHB患者，治療后ALT恢復正常，HBV DNA＜105拷貝/mL，但無HBeAg血清學轉換。無應答組(n=10):未達到以上應答者。

1.2 CD28表達情況的檢測 ①外周血單個核細胞(PBMC)的分離:在被檢測者抗凝血中加入等體積Hank’s液，混合均勻。取一個10 mL無菌離心管，加入4 mL Ficoll液于離心管底部，用移液管將稀釋的血液緩慢加入到Ficoll液上層，此時試管內的液體分為2層，上層為稀釋的血液，下層為Ficoll液。靜置10 min后1 700 r/min離心20 min。離心后，上清液分為5層，分別為血漿層、PBMC層、Ficoll液層、粒細胞層和紅細胞層。棄去血漿，將PBMC層轉移到另外一個無菌試管中，用Hank’s液洗滌，1 700 r/min離心，棄上清，共洗滌3次，獲得PBMC。②外周血淋巴細胞CD4、CD8、CD28的檢測:采用熒光素二抗體標記法結合流式細胞儀檢測，取專用試管依次加入 PBMC(濃度1×106mL－1)、CD4/CD28、CD8/CD28單克隆抗體各20 μL，混勻置暗處室溫放置30 min，每管再加 PBS 0.5 mL混勻置4℃待測，流式細胞儀測定分析采用BD公司GENQUES軟件(每次獲取10 000個細胞統計結果)。

1.3 統計學處理 應用SPSS 11.5進行統計學分析，采用單因素方差分析比較各組治療前后CD4+CD28+和CD8+CD28+變化量的差異，兩兩比較采用 LSD-t檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

3組患者抗病毒治療前后CD28表達情況比較見表1。

表1 3組患者抗病毒治療前后CD28表達情況比較 %

3 討論

拉米夫定是目前臨床抗病毒治療的一線藥物之一，它能顯著抑制HBV復制，改善肝臟生化功能和肝組織學病變。Yuen等［4］的研究結果表明，CHB患者長期服用拉米夫定治療可明顯降低肝硬化和肝癌發生率。雖然多數CHB患者對拉米夫定反應良好，但仍有部分患者經拉米夫定治療后應答不佳，甚至無應答。因此，如何提高CHB患者對抗病毒治療的應答率，是目前臨床醫生關注的熱點問題。

目前已經明確，T淋巴細胞在清除病毒的過程中作用十分關鍵，靜止 T細胞必須接受抗原提呈細胞提呈的雙信號才能活化，第一信號是抗原特異性的;第二信號是由T細胞上的CD28與抗原提呈細胞上的B7分子結合而提供的。只有兩個信號同時存在時，T細胞開始增殖并分泌相應細胞因子。若沒有CD28提供第二信號，T細胞識別抗原后不能充分活化并表現效應功能，則導致 T細胞無能。Hara等［5］研究發現，通過同時阻斷 CD28和誘導性協同刺激分子，可使淋巴細胞活性失能;Fan等［6］研究發現，通過阻斷 CD28/B7可抑制 T細胞活化，并能誘導免疫耐受。CHB患者T淋巴細胞表面CD28分子數量減少，可能是病毒難以清除的原因之一［7-8］。作者觀察了CHB患者服用拉米夫定抗病毒治療前后細胞表面CD28的表達情況，結果顯示對拉米夫定產生完全應答的患者，在治療之前體內即有較高水平的CD28表達，而無應答者體內CD28表達則較低。這說明CD28的高表達可有效提高拉米夫定抗病毒療效，T淋巴細胞表面CD28的表達水平與患者對拉米夫定的應答有關，可作為拉米夫定療效預測的指標。拉米夫定無免疫調節作用，但拉米夫定治療過程中卻可能導致患者免疫功能的變化，趙紅霞等［9］研究發現，拉米夫定抗病毒治療變異后機體出現免疫功能改變，并推測這種改變可能與治療后病毒種群變化有關。該實驗中，各組患者經拉米夫定治療后，其細胞表面CD28表達均較治療前提高，表明拉米夫定治療后機體細胞免疫功能有一定改善，可能與體內病毒載量減少，病毒血癥對機體的免疫抑制作用得到緩解有關［10］。

理想的抗病毒方案應該能夠激活足夠的免疫細胞，但盡可能減少肝細胞的損傷，并能中止病毒持續的感染。而CD28則類似一個樞紐，與B7家族分子等構成精密調控免疫反應的網絡，在保證機體體內免疫穩態的同時，對外來抗原產生特異應答［11］。如何有效上調體內T淋巴細胞表面CD28的表達，充分激活T淋巴細胞，對于CHB患者的抗病毒治療有重要意義，值得進一步探討。

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［11］張儀，韓波.CD28在疾病治療中的作用研究進展［J］.實用兒科臨床雜志，2008，23(15):1204