肺結核繼發真菌感染患者分離真菌的基因檢測與鑒定的研究

張 麗

（廣州市花都區慢性病防治所，廣東 廣州 510800）

肺結核患者由于病程較長，長期的慢性消耗導致機體細胞免疫功能低下，肺組織及支氣管結構均有不同程度的破壞，特別是病情較重的結核患者,往往由于肺部結核病變廣泛，存在干酪樣壞死和空洞等，使局部抵抗力降低，容易受到各種致病因子的侵襲，加上某些病例合并有糖尿病或其他疾病長期應用皮質激素等免疫抑制劑，使機體的抵抗力更為下降。因此結核患者合并真菌感染的狀況日益增多，其中呼吸系統真菌感染占首位[1]。從2005年1月至2010年12月我單位收治肺結核患者3 049例，其中80例肺結核患者合并真菌感染。為探討肺結核繼發真菌感染患者分離真菌的基因鑒定及其類型，本文對80例肺結核患者呼吸道分泌物分離的99株真菌進行了生物學研究和基因鑒定及其分型，現將結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 肺結核合并真菌感染的患者80例，其中男性58例，女性22例，年齡18～63歲，平均47.8歲，X線檢查和痰涂片(+)。所有病例痰連續3次培養均有酵母菌或霉菌生長。

1.2 培養基與試劑 Chrom培養基由上海科瑪嘉微生物有限公司提供，微量生化反應管與試劑由杭州天和微生物試劑公司提供，白假絲酵母菌A型標準株ATCC 64550由樂通泰生物科技有限公司提供，ITS引物序列由北京賽百盛基因技術有限公司提供，白假絲酵母菌分型引物由上海生工公司合成，Taq酶、dN TP采用寶生物公司預混PCR試劑盒，Lyitcase細胞溶解酶由上海易佰聚有生物有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 真菌分離與鑒定 以咳痰法或氣管插管吸引法采集患者下呼吸道分泌物標本[2]，接種于沙氏培養基，28℃培養48～72 h后，進行涂片革蘭染色鏡檢，凡假絲酵母菌劃線接種于Chrom瓊脂平板，置普通溫箱內28℃培養48～72 h，凡培養基上呈優勢生長的菌落判斷為引起感染的病原菌，再進一步鑒定[3]。

1.3.2 常規方法鑒定 各分離菌株分別進行形態或/和生化反應鑒定。假絲酵母菌根據在Chrom培養基生長菌落的顏色、芽管試驗、厚膜孢子形成試驗、糖發酵及糖同化試驗結果鑒定其菌種；霉菌根據菌落培養和形態特征以及鏡下孢子和菌絲特點鑒定其菌種。

1.3.3 ITS檢測與鑒定(真菌種間分型)

1.3.3.1 真菌基因組DNA的抽提 菌液離心后，用1 mol/L的山梨醇洗一次，用酵母用溶細胞酶[Lyticase(Sigma)]消化，獲取原生質體。用10 g/L的十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解，苯酚氯仿混合提取法提取DNA[4]。

1.3.3.2 引物的設計與合成 引物序列ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，19 mer；ITS2：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'，20 mer。 引 物稀釋：用TE緩沖液稀釋引物，終濃度為10 μmol/L。

1.3.3.3 PCR擴增 78株酵母菌與21株霉菌分別進行ITS序列的PCR擴增，條件與步驟為：反應體系總體積為50 μl，包括10×PCR 緩沖液5 μl，200 μmol/L dNTP，2 U Taq酶，引物 ITS1 和ITS2 各2 μl，蒸餾水補至50 μl。PCR反應在熱循環儀上進行，95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個循環，而后72℃保持3 min延伸。

1.3.4 擴增產物分析 采用瓊脂糖凝膠電泳法。PCR 產物5 μl與溴化乙啶2 μl混合，電泳緩沖液TBE，電壓140 V，在含0.5 μg/ml溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，以50 bp、100 bp DNA梯型為分子量標準，電泳結果在紫外燈下觀察。

1.4 白假絲酵母菌基因型分析 引物合成采用特異引物擴增白假絲酵母菌基因組DNA的25 S rDNA基因的內含子區，以內含子大小約379 bp及其中可轉座Ⅰ型內含子片段的缺失或插入作為分型依據。一對分型引物P1、P2分別位于可轉座Ⅰ型內含子的兩翼[5]。P1：5'-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATA GATCCGTAA-3'(上游引物)，30 mer，P2：5'-CCTTGG CTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3'(下游引物)，30 mer。引物稀釋：用TE緩沖液稀釋引物至終濃度為10 μmol/L。PCR擴增方法如1.3.3.3。

2 結 果

2.1 病原性真菌種間分型結果 99株真菌的ITS序列鑒定結果及其與生物學鑒定的關系：酵母菌78株，符合率為83.3%；霉菌21株，符合率為71.4%；總符合率為80.8%，見表1和圖1。

表1 肺結核合并真菌感染患者病原性真菌的ITS鑒定結果(株)

圖1 病原性真菌的ITS序列PCR擴增產物電泳結果

2.2 病原性真菌的基因型 以P1、P2為引物，以白假絲酵母菌臨床分離株DNA為模板進行PCR擴增，根據PCR產物的電泳圖譜，插入的可轉座Ⅰ型內含子片段大小約379 bp。49株白假絲酵母菌經25S rDNAⅠ型內含子基因鑒定分為3型，包括基因A型21株(40.8%)、基因B型14株(28.5%)以及基因C型15株(30.6%)，未發現基因D型與基因E型菌株(圖2)。PCR分型實驗的重復實驗結果相同，條帶清晰，條帶大小差異無統計學意義。

圖2 白假絲酵母菌25S rDNAⅠ型內含子序列PCR擴增產物電泳結果

3 討論

肺結核是一種慢性消耗性疾病，患者病程較長，肺組織及支氣管結構均有不同程度的破壞，呼吸系統防御功能降低，易患二重感染，尤其是合并真菌感染。真菌的檢測目前主要依靠常規直接鏡檢或培養。直接鏡檢操作簡便、快速、實用，但檢測陽性率較低，陰性結果不能排除感染，需與培養和生化鑒定結合使用，培養時間需2～3 d，耗時較長，檢出率低。近年來檢測真菌循環抗原(抗體)、特異性酶和代謝產物的血清學方法則存在特異性和敏感性低的缺陷。分子生物學的的出現使得真菌的檢測技術得到了很大發展，不僅能檢測出活的致病菌，而且能檢測出死亡的和難以培養的真菌[3]。

隨著真菌學研究的不斷深入，許多病原真菌的基因組序列已探明。根據這些已知序列可以選擇其保守區域設計具有種、屬特異性的引物用于醫學真菌的檢測。真菌核糖體基因轉錄間隔區(Internal tran scribed spacer region，ITS)是位于真菌核糖體DNA(rDNA)上18S和28S基因之間的區域片段，該區域進化較快，具有一定的種間特異性和種內保守性，可將假絲酵母菌鑒定到種、亞種[5-6]。本課題結果進一步證實，傳統生物學方法能夠正確地鑒定絕大多數病原性真菌的菌種，而檢測ITS序列則有利于真菌感染的快速診斷和提高真菌鑒定的準確率以及基因型分析與研究。本方法與傳統分型方法和其他分子生物學方法相比，具有快速、簡捷、可靠的優點。PCR基因分型方法具有快速、簡捷、可靠、重復性好等優點。實驗從模板DNA提取到PCR擴增后電泳觀察結果，共耗時7 h左右，可在一個工作日內完成，比較適合臨床真菌菌種內和種間分型研究。本課題應用靈敏特異的PCR分型方法，采用真菌通用引物ITS1、ITS2擴增念珠菌中18、518S rDNA基因的小段片段及其之間的內轉錄間隔區ITS1，利用其擴增產物片段的大小不同將13種常見真菌鑒定出來。99株真菌的ITS序列鑒定結果及其與生物學鑒定的關系：酵母菌78株，符合率為72.4%；霉菌21株，符合率為85.7%；總符合率為84.8%。白假絲酵母菌在25S rDNA編碼區內存在一可轉座Ⅰ型內含子核苷酸序列，根據內含子缺失以及形成的片段大小，可將白假絲酵母菌分為A、B、C、D、E五個基因型[7]。國內學者郭新美等[8]報道，在74例肺結核繼發真菌感染病例中以假絲菌居多，其中白假絲菌為主，占70.3%；光滑假絲菌占12.2%；熱帶假絲菌占6.8%；另外還有少數隱球菌、曲霉菌、毛霉菌。陳素麗等[9]報道也是以假絲菌屬居多，其中白假絲菌占51.5%，光滑假絲菌占19.9%，熱帶假絲菌占11.8%，曲霉菌占8.1%，毛霉菌占1.5%。本研究結果顯示檢出99株真菌中以白假絲酵母菌為主。49株白假絲酵母菌經25S rDNAⅠ型內含子基因鑒定分為3型，包括基因A型21株(40.8%)、基因B型14株(28.5%)以及基因C型15株(30.6%)，未發現基因D型與基因E型菌株。基因A型、B型和C型是常見的病原性白假絲酵母菌，其中以基因A型的檢出率最高。提示花都區肺結核合并真菌患者的病原性白假絲酵母菌也同樣以基因A型、B型和C型常見，但基因A型占明顯多數。本研究探討花都區肺結核患者合并真菌感染情況以及病原性真菌常見種類、分布及基因型，實驗證明檢測ITS序列和25S rDNAⅠ型內含子序列有助于真菌感染的快速基因診斷和提高菌種鑒定的準確率。用于控制醫院內感染和預防肺結核患者合并真菌感染，對肺結核合并真菌感染患者的治療和預防具有重要的臨床意義。

[1]胡 華,林美英,鞠云飛.老年肺結核合并肺部真菌感染的臨床及藥敏研究[J].臨床肺科雜志,2006,11(5)：154-156.

[2]葉應嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規程[M].南京：東南大學出版社,2006：744-745,871-885.

[3]Corrêa Pdos R,David PR,Peres NP,et al.Phenotypic characterization of yeasts isolated from the vaginal mucosa of adult women[J].Rev Bras Ginecol Obstet,2009,31(4)：177-181.

[4]周曾同,趙 民,張 濟,等.口腔白色念珠菌的PCR ITS12ITS2基因分型法的建立及應用[J].實用口腔醫學雜志,2006,22(1)：60-63.

[5]高 飛,陳德利,沈亮亮,等.隨機分離致病性白假絲酵母菌17例的基因分型[J].同濟大學學報(醫學版),2004,25(3)：678-680.

[6]李勁松,宋詩鐸,祁 偉.深部白假絲酵母菌感染臨床分離株基因分型及藥敏分析[J].中國抗生素雜志,2004,29(7)：426-429.

[7]李艷華,馮福民,郭 梅.惡性腫瘤患者念珠菌感染臨床分離株的基因型特征研究[J].中國老年學雜志,2007,27(18)：345-356.

[8]郭新美,榮學東,馬秀麗.74例肺結核繼發肺部真菌感染情況分析[J].中國防癆雜志,2005,27(6)：380-382.

[9]陳素麗,李幸彬,李衛紅.肺結核合并肺部真菌感染136例臨床分析[J].臨床薈萃,2006,21(18)：1323-1324.