超聲波提?。悴ㄩL同步熒光法測定淡水藻中葉綠素a的含量

吳俊森 萬修志 馬永山 孫韶華

(1．山東建筑大學市政與環境工程學院，山東濟南250101;2．濟南市供排水監測中心，山東濟南250033)

由于受到水源富營養化的影響，我國許多以湖泊水庫為水源的給水廠原水含有不同程度的藻類，藻類會釋放藻毒素，威脅供水水質的安全。葉綠素是藻類的主要光合色素，常見的是葉綠素a，其含量大約是藻干重的1% ～2%，是藻類生物量的重要指標［1］。目前國內在該領域采用的葉綠素a測定方法多采用分光光度法和普通熒光法，因分光光度法不如熒光法靈敏，現在多采用熒光法。但對綠藻來說其色素種類較多，特別是存在葉綠素b，其熒光激發和發射光譜與葉綠素a有嚴重重疊，再加上噪音信號的干擾，利用普通熒光光譜很難單獨對葉綠素a進行定性和定量分析［2］。

為避免其它色素光譜的干擾，人們多采用同步熒光法對葉綠素a的熒光光譜進行測定［3］，該方法同時掃描熒光分光光度計的激發和發射兩個單色器波長，由測得的熒光強度信號與對應的激發波長(或發射波長)構成光譜圖。與常規熒光法相比，同步熒光法能夠簡化光譜，減少瑞利散射和拉曼散射的干擾，使譜峰變窄，從而提高了測定的選擇性和靈敏度。黃賢智等建立了葉綠素a和葉綠素b的同步熒光分析法并用于菜葉中兩種色素的測定［4］;唐堯基等應用同步熒光法分析了海水中葉綠素a的含量［5］。同步熒光法用于綠藻中葉綠素a的測定尚未見文獻報道。此外，傳統葉綠素的提取，耗時長且有可能提取不完全，近來，超聲波提取(也稱為萃取)以其提取溫度低、提取率高、提取時間短的獨特優勢被廣泛應用于中藥材和各種動、植物有效含量的提取。我們通過比較不同提取方式發現，選擇小球藻為分析對象時，以90%丙酮為提取劑，采用超聲波提取法，可節省操作步驟，并有助于提高葉綠素提取效率。在此基礎上，本文以小球藻為例，建立了超聲波提?。綗晒夥y定綠藻中葉綠素a含量的新方法，其線性范圍為 0．02 ～1．25 mg/L，檢出限為1．6ug/L。

1 實驗部分

1．1 供試生物材料與培養方法

本試驗所用小球藻種由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供。采用一次性培養方法，溫度為25℃ ±1℃，光強為3000Lux，培養液采用SE培養基，用于實驗的藻液為接種2次以上的已適應上述生長條件的處于指數生長期的藻。

1．2 儀器與試劑

KQ250DB型浴槽式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TBL－40B型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);0．45μm醋酸纖維濾膜(上海半島實業有限公司凈化器材廠)。F－4500型熒光分光光度計(日本日立公司)，掃描速度240 nm/min，帶通5nm;葉綠素a、葉綠素b(Sigma公司):分別用90%丙酮配制成1．0 mg/10mL的儲備液，保存于冰箱中(4℃)備用。所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1．3 實驗方法

取適量葉綠素a、b標準溶液置于10 mL容量瓶中，用90%丙酮稀釋至刻度，搖勻;采用熒光分光光度計，選擇適當的激發和發射波長，測定標樣的熒光激發和發射光譜以及同步熒光光譜。取培養好的小球藻溶液，加入體積為水樣5%的飽和碳酸鎂溶液，用0．45μm水溶性醋酸纖維濾膜減壓過濾，使小球藻截留在濾膜上，抽干，再加入10mL90%丙酮提取劑，蓋好，超聲波萃取0．5h(超聲功率:100%)，離心后取上清液進行同步熒光法測定。

2 結果與討論

2．1 萃取方式對葉綠素提取效果的影響

研究了各種萃取方式包括加熱法、研磨法及超聲波萃取法等對葉綠素a提取效果的影響，結果證明當以90%丙酮為提取劑，采用超聲波提取方式，可節省操作步驟及時間，并有助于提高葉綠素提取效率，比國家環?？偩帧端蛷U水監測分析方法》推薦的研磨法提取效率高。

2．2 熒光光譜譜圖

分別掃描90%丙酮空白、小球藻浸泡液和葉綠素a－90%丙酮溶液的熒光光譜。采用λex=444nm掃描熒光發射光譜，λem=660nm掃描其熒光激發光譜，△λ=216nm掃描其同步熒光光譜;扣除90%丙酮后，得葉綠素a標準液的熒光激發光譜、熒光發射光譜以及同步熒光譜圖(圖1)。

圖1 葉綠素a標準液的熒光激發(實線)、發射(折線)及同步熒光(點線)光譜

分析小球藻提取液中的葉綠素a時，所分析的體系未經提取、凈化等步驟，待測溶液存在一定的干擾，葉綠素a的激發和發射光譜受其它色素特別是葉綠素b的干擾而變形，峰形不如同步譜那樣完整。如圖2所示。因此選用同步熒光光譜用于分析小球藻提取液，比激發譜或發射譜更有利于在復雜的體系中區分出葉綠素a的信號。

2．3 葉綠素b干擾考察

考察了葉綠素b對葉綠素a同步熒光信號強度的影響情況。在葉綠素a的90%丙酮標準溶液(0．5mg/L)中加入 0．2mg/L、0．4mg/L、0．6mg/L、0．8mg/L、1．0mg/L 的葉綠素b，檢測加入后的熒光信號，并與未加葉綠素b的葉綠素a溶液的熒光信號作比較，結果表明，葉綠素a的同步熒光信號基本不受葉綠素b的影響。小球藻浸取液中還有其他色素物質的存在，如葉黃素和胡蘿卜素等，這些物質的熒光激發和發射光譜與葉綠素a的沒有干擾，不對該分析體系造成明顯的影響。

圖2 小球藻浸泡液的熒光激發(實線)、發射(折線)及同步熒光(點線)光譜

在同一小球藻提取液樣品中加入不同量的葉綠素a，選用△λ=216nm進行萃取液的同步熒光掃描，由同步熒光峰信號(高度)對應其濃度繪制工作曲線，如圖3所示。葉綠素a的加入量與同步熒光峰強度F呈良好的線性關系，因此，同步熒光法對消除小球藻中存在的其他色素和干擾物質對測定的影響是非常有效的。同步熒光法用于測定綠藻中葉綠素a的含量是可行的。

圖3 葉綠素a加入量與熒光強度關系標準曲線

2．4 工作曲線及檢出限

采用同步熒光法對葉綠素a的90%丙酮標準溶液進行熒光掃描，由同步熒光峰信號(高度)對應其濃度繪制工作曲線，其線性回歸方程為Y=3110．5x+198．48，相關系數為0．9991，線性范圍為0．02 ～1．25 mg/L。在相同的實驗條件下測定11份小球藻空白，根據3倍標準偏差計算其檢出限為1．6ug/L。對葉綠素a含量為1．0mg/L的標準溶液進行了11次平行測定，其相對標準偏差為0．48%。

2．5 加標回收實驗

為了考察方法的可靠性，課題組對本實驗室培養的小球藻提取液樣品進行加標回收實驗，分別添加濃度為0．5mg/L的葉綠素a標準溶液到樣品中，平行三次，測得回收率在97．0% ～104%之間，結果說明，建立的方法對小球藻中葉綠素a的測定準確度能夠滿足測定要求。實驗結果見表1。

表1 樣品中葉綠素a回收率的測定結果

2．6 同步熒光法與分光光度法測定結果的比較

對4份小球藻萃取液樣品分別采用國家環?？偩帧端蛷U水監測分析方法》推薦的分光光度法和同步熒光法進行葉綠素a的重復測定，結果列于表2，由數據對比可以看出同步熒光法與分光光度法測定結果無顯著性差異，但該方法具有快速、靈敏，其他常見色素不干擾測定的優點。

表2 分別采用分光光度法及同步熒光法獲得的小球藻提取液中葉綠素a濃度

3 結論

綠藻色素成分復雜，采用超聲波提?。綗晒鈾z測法測定綠藻中的葉綠素a，節省了操作步驟，提高了葉綠素提取效率，避免了散射干擾，方法選擇性和靈敏度高，檢出限達到1．6ug/L，而且具有簡便快捷的特點，能夠滿足供水快速檢測的需要。

(編輯:溫武軍)

［1］呂洪剛，張錫輝，鄭振華，歐陽二明．原水藻與葉綠素a定量關系的研究［J］．給水排水，2005，31(2):26－29．

［2］高洪峰，焦念志．通過藻類色素分析估測海洋浮游植物生物量和群落組成的研究進展［J］．海洋科學，1997(3):51－53．

［3］Patra D，Mishra A K．Recent Developments in Multi-component Synchronous Fluorescence Scan Analysis［J］．Journal of Scientific and Industrial Research，2002，21(12):787 －798．

［4］黃賢智，許金鉤，蔡挺．同步熒光分析法同時測定葉綠素a和葉綠素 b［J］．高等學校化學學報，1987，8(5):418 －420．

［5］唐堯基，游文瑋，陳瑩，李耀群．同步熒光法測定海水中葉綠素a的含量［J］．分析儀器．2004，(3):24－26．