嬰幼兒喘息性疾病外周血嗜酸性粒細胞Caspase-3的表達及意義

楊曉麗，盧先鋒，席秀琴

(山西省人民醫院，山西太原 030012)

喘息是嬰幼兒時期的常見癥狀。喘息性疾病是以喘息為主要癥狀、具有反復發作或以后可能反復發作為特點的數種呼吸系統疾病的總稱[1]。主要是由于各種原因導致支氣管反應性增高、支氣管黏膜水腫，且分泌物增多、黏稠，管壁平滑肌收縮使氣道發生可逆性痙攣和狹窄。常見的嬰幼兒喘息性疾病包括毛細支氣管炎、喘息性支氣管炎和支氣管哮喘，其發病率有逐年上升的趨勢。喘息性嬰幼兒的血中和氣道分泌物中存在大量類似哮喘患兒所特有的炎性物質[2]。以嗜酸性粒細胞(Eosi-nophils，EOS)為主的炎性細胞浸潤是變態反應性炎癥的特點。作為變態反應性疾病，嗜酸性粒細胞介導的炎癥在哮喘的發病過程中起著重要的作用[3]。本試驗通過檢測喘息性嬰幼兒外周血中的嗜酸性粒細胞及其 Caspase-3的活性表達，探討Caspase-3活性表達與嗜酸性粒細胞凋亡的關系，進而為嬰幼兒喘息性疾病的防治提供可能的理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2009年9月至2011年4月在山西省人民醫院兒科住院治療的2個月至3歲喘息性嬰幼兒120例，男性68例，女性52例。除外先天性心臟病、結核感染及支氣管異物等疾病引起的喘息。120例中27例支氣管哮喘的診斷符合2004年中華醫學會兒科分會呼吸學組制定的兒童支氣管哮喘防治常規[1]，74例毛細支氣管炎的診斷符合《實用兒科學》毛細支氣管炎診斷標準，19例肺炎衣原體感染性肺炎的診斷符合《諸福棠實用兒科學》診斷標準[4]。2個月～1歲組45例，男性17例，女性28例，平均年齡(0.7±0.2)月;～2歲組35例，男性26例，女性9例，平均年齡(1.5±0.1)歲;～3歲組40例，男性25例，女性15例，平均年齡(2.4±0.3)歲。健康對照組30例，均為健康體檢嬰幼兒，男性16例，女性14例，年齡4個月～3歲，平均年齡(1.6±0.2)歲。所有嬰幼兒均為足月出生，組間性別、年齡差異均無統計學意義(P＞0.05)，均獲得其家長知情同意。

1.2 檢測方法

所有入選患兒均取空腹靜脈抗凝血2份，每份4mL，分別進行嗜酸性粒細胞計數及嗜酸性粒細胞Caspase-3 活性表達的檢測[5]。

1.2.1 嗜酸性粒細胞的分離

靜脈采血4mL(肝素抗凝)，加入4mL4.5%DextranT 500中，37℃ 30min沉淀紅細胞，取含白細胞血漿層200 g離心10min，去除血小板，PBS液漂洗2次，400 g離心7min，用含5%小牛血清的 D-Hank＇s液制成2mL白細胞懸液，在37℃孵育30min，加入已加好1.100、1.090、1.085 等滲 Percoll密度液各2mL的離心管(1 000 g離心30min)中，取1.100、1.090 處細胞，然后用D-Hank＇s液漂洗2次即為所獲EOS。將獲取的EOS倒入玻璃勻漿管中，用勻漿介質沖洗，于4℃制成10%的勻漿，3 000 r/min離心15min，取上清液，用于Caspase-3活性的檢測。

1.2.2 血清嗜酸性粒細胞計數及其Caspase-3活性表達的檢測

血清嗜酸性粒細胞計數由(XE-2100全自動血液分析儀檢測)日本東亞公司生產。嗜酸性粒細胞Caspase-3活性表達的檢測，采用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測(上海生研生物科技有限公司生產)。

1.3 統計學處理

應用SPSS13.0軟件進行統計學檢驗分析，統計學處理結果計量數據用±s表示，組間兩兩比較均采用秩和檢驗，以P﹤0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

各喘息組外周血EOS計數與對照組比較，各喘息組外周血EOS計數均高于對照組(均P＜0.05)，各喘息組兩兩之間差異無統計學意義(均P＞0.05)，見表1。各喘息組外周血嗜酸性粒細胞Caspase-3活性表達與對照組比較均低于對照組(均P＜0.05)，各喘息組兩兩之間差異無統計學意義(均P＞0.05)，見表1。

表1 各組EOS計數及Caspase-3活性表達(±s)Table 1 EOS Count and Activity Expression of Caspase-3 in Each Group(±s)

表1 各組EOS計數及Caspase-3活性表達(±s)Table 1 EOS Count and Activity Expression of Caspase-3 in Each Group(±s)

組別 EOS計數(×109/L)Caspase-3/(mmol·L-1)對照組0.082 5±0.251 6 16.42±1.47 2個月～1歲 1.108 2±0.245 1 6.56±1.85～2歲 1.081 4±0.156 2 7.42±2.01～3歲 1.114 2±0.223 8 6.38±1.74 H值4.015 2 13.021 6 P值0.012 4 0.007

3 討論

嬰幼兒喘息性疾病是嬰幼兒時期呼吸系統常見疾病，嬰幼兒喘息的主要臨床表現是氣喘、咳嗽、呼吸困難、肺部常可聞及哮鳴音及濕啰音。2003年，Taussig等[6]報導了Tucson兒童的呼吸研究，對1 246例出生后的嬰兒進行隨訪觀察，內容包括危險因素、急性呼吸道感染和慢性肺疾病等因素，將嬰幼兒喘息分為三種類型:一過性的早期喘息、非過敏性的喘息和晚發的喘息及哮喘。

由于嬰幼兒呼吸系統及免疫系統正處于發育階段，嬰幼兒時期某些病原體的感染，很可能影響到機體的免疫系統及呼吸系統的發育，易發生喘息，甚至發展為哮喘[7]。以往認為，在小兒時期，喘息性疾病多與病毒或細菌感染有關，但近年研究顯示喘息性疾病臨床及病理都有類似哮喘的表現，此類患兒的血中和氣道分泌物中存在大量類似哮喘患兒所特有的炎性物質，可致支氣管平滑肌痙攣，血管舒張致血漿滲出及水腫[2]。

外周血嗜酸性粒細胞是變態反應疾病如支氣管哮喘、過敏性鼻炎中的一種關鍵效應細胞[8]，嗜酸性粒細胞可以釋放多種炎性介質和毒性蛋白，在嬰幼兒喘息形成和發展過程中起重要作用。

細胞凋亡是一個十分復雜的過程，具有復雜性、多樣性，不同應激、不同細胞存在不同的信號轉導途徑。哺乳動物維持正常的生理活動需要多種信號轉導途徑，這些信號通路之間相互作用，在體內構成一個復雜的信號網絡，這種信號網絡有利于維持機體細胞對信號刺激反應的完整性和協調性[9]。Caspase分為三大類:凋亡啟動因子、凋亡執行因子和炎癥介導因子，構成了級聯放大效應。凋亡啟動因子在級聯反應的上游，包括Caspase-2、Caspase-8等，能在其他蛋白輔助下發生自我活化并識別和激活下游的Caspase而誘發凋亡[10，11]。凋亡執行因子在級聯反應的下游，包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等，作用于其特異性底物并導致細胞凋亡，Caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的 Caspase家族中的關鍵蛋白酶，是Caspase家族中的最重要的凋亡執行者之一，是細胞凋亡過程中的主要效應因子，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志[12]。

本研究發現，3歲以下嬰幼兒喘息性疾病過程中，其外周血嗜酸性粒細胞計數高于健康嬰幼兒外周血嗜酸性粒細胞計數，表明嗜酸性粒細胞參與了嬰幼兒喘息性疾病的發生、發展過程。通過測定喘息性嬰幼兒嗜酸性粒細胞中Caspase-3的活性發現，喘息性嬰幼兒嗜酸性粒細胞中Caspase-3的活性低于健康嬰幼兒嗜酸性粒細胞中Caspase-3的活性，提示在喘息性嬰幼兒嗜酸性粒細胞凋亡過程中，可能存在某種因素抑制了Caspase凋亡因子的激活，從而延緩了嗜酸性粒細胞的凋亡，導致外周血嗜酸性粒細胞升高，進而使嗜酸性粒細胞參與嬰幼兒喘息性疾病的發生發展過程。抑制Caspase凋亡因子激活的原因仍待進一步研究，喘息性嬰幼兒外周血嗜酸性粒細胞的凋亡抑制，除了Caspase-3活化受到抑制外，可能還存在其他凋亡抑制作用途徑，有待于今后進一步研究。

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