枯草芽孢桿菌3－2產細菌素發酵條件的優化

楊宇清，鄭一敏，胡 楊，樂 亮，江 娟，王 寧，林海珠

(重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054)

隨著社會的進步，人們越來越追求方便、快捷、安全、健康的食品，但是食品在加工、儲藏過程中很容易受到細菌、霉菌、酵母的污染，導致腐敗變質，因此，研發安全、有效的食品防腐劑，是食品工業發展的關鍵問題之一［1］?？莶菅挎邨U菌在自然界中廣泛存在，對人畜無害，且不污染環境，具有極好的抗菌活性和極強的抗逆能力［2－3］，其代謝產物具有極高利用價值和開發前景［4］。本文以一株本實驗室分離得到的具有很強拮抗作用的枯草芽孢桿菌為研究對象，對其搖瓶發酵培養基及發酵條件進行優化，為該菌種規模化發酵提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

1.1.1 菌種

供試菌株:枯草芽孢桿菌3－2(重慶理工大學藥學與生物工程學院天然藥物實驗室保藏);指示菌株:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(重慶理工大學藥學與生物工程學院天然藥物實驗室保藏)。

1.1.2 培養基

種子液體培養基:酵母膏 5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值為7.0 ～7.2;種子固體培養基:在液體培養基的基礎上添加1.5%瓊脂粉;指示菌培養基:同種子培養基。

1.2 發酵液的制備

保存菌種經活化后從斜面上挑取一環接種于裝有30 mL種子培養基的100 mL的三角瓶中，37℃ 下180 r/min搖床培養12 h，制得種子液。以5%接種量將種子液接種到裝有200 mL發酵培養基的500 mL的三角瓶中，37℃下180 r/min搖床培養24 h制得發酵液。

1.3 指示菌懸液的制備［5］

保存菌種經活化后從斜面上挑取一環接種于裝有30 mL種子培養基的100 mL的三角瓶中，37℃ 下180 r/min搖床培養24 h，制得菌懸液.用10倍稀釋法將菌液稀釋、計數，求得菌懸液濃度，稀釋成106～107mL－1保存備用。

1.4 活性評價方法－瓊脂擴散法［6］

發酵液經10 000 r/min離心10 min收集上清液，再經0.22 μm過濾膜過濾除菌，即制得抗菌粗提液。取上述指示菌菌懸液200 μL與15 mL固體培養基混勻倒平板，待培養基凝固后，用無菌鑷子放入吸有抗菌初提液500 μL的自制海綿圈，37℃培養24 h后測定抑菌圈直徑，重復3次。

1.5 試驗設計

1.5.1 發酵培養基的篩選

選取下述5種常用的細菌培養基作為供試菌的發酵培養基，篩選最適發酵培養基，每組試驗重復3次。培養基如下:

1)LB 培養基:酵母膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.0 ～7.2。

2)NB 培養基:牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 5.0 g，葡萄糖 2.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.0。

3)BPY 培養基:葡萄糖 10.0 g，蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，牛肉膏 5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.0。

4)Landy培養基:葡萄糖 20.0 g，L－谷氨酸5.0 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO41.0 g，FeSO4·6H2O 0.15 mg，MnS04·H2O 5.0 mg，CuSO4·5H2O 0.1 6mg，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.0。

5)NYD 培養基:牛肉膏 8.0 g，酵母膏 5.0 g，葡萄糖 1.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值為7.0。

1.5.2 培養時間對產細菌素的影響

采用最適發酵培養基，按本文1.2節方法制備發酵液，每隔4 h取樣，按本文1.4節方法測定發酵液的抑菌活性，考察培養時間對產細菌素的影響，重復3次。

1.5.3 培養溫度對產細菌素的影響

分別在28、30、32、35、37、40 ℃條件下培養。培養條件按本文1.5.2節優化后條件，并按本文1.4節方法測定各發酵液抑菌活性，考察溫度對產細菌素的影響，重復3次。

1.5.4 初始pH對產細菌素的影響

以最適發酵培養基為基礎，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH 分別調節 pH 值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5，培養條件按本文 1.5.3 節優化后條件，并照本文1.4節方法測定各發酵液抑菌活性，考察培養基初始pH值對產細菌素的影響，重復3次。

1.5.5 裝液量對產細菌素的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入體積為50、100、150、200、250的最適發酵培養基。培養條件為本文1.5.4節優化后條件，并按本文1.4節方法測定各發酵液抑菌活性，考察裝液量對產細菌素的影響，重復3次。

1.5.6 接種量對產細菌素的影響

按本文1.2方法制備種子液，分別以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0% 和8.0%(v/v)的接種量接種，培養條件按本文1.5.5節，并按本文1.4節方法測定各發酵液抑菌活性，考察接種量對產細菌素的影響，重復3次。

1.5.7 接種齡對產細菌素的影響

按本文1.2節方法制備種子液，分別取培養12、18、24、30和36 h的種子液接種于最適發酵培養基中，培養條件按本文1.5.6節優化后條件，并按本文1.4方法測定各發酵液抑菌活性，考察接種齡對產細菌素的影響，重復3次。

2 結果

2.1 發酵培養基篩選結果

5種發酵培養基發酵液抑菌活性的結果如表1所示。培養基的組分及含量對發酵液抑菌活性的影響很大，BPY培養基的發酵液抑菌活性最高，而其他4種培養基的發酵液抑菌活性都較低，因此，選擇BPY培養基作為供試菌種的最適發酵培養基。

表1 不同培養基發酵液抑菌活性測定結果

2.2 培養時間對產細菌素的影響

培養時間對菌株3－2產細菌素的影響的試驗結果如圖1所示，發酵4～8 h已經有細菌素產生。24 h后，發酵液的活性已達到最高。延長發酵時間活性無明顯變化，且發酵液對兩種指示菌的抑菌效果的趨勢相相似，所以選擇24 h作為發酵終點。

圖1 培養時間對產細菌素的影響

2.3 培養溫度對產細菌素的影響

對3－2菌株產細菌素的影響的試驗結果如表2所示。隨著溫度的升高，發酵液的抑菌活性逐漸增強，35℃時活性最強。溫度繼續升高，活性開始下降。當溫度升至40℃，發酵液活性已經很弱，所以選用35℃作為最適發酵溫度。

2.4 初始pH值對產細菌素的影響

初始pH對菌株3－2產細菌素的影響的試驗結果如表3所示。pH值在5.5～8.0內菌株均能產細菌素，以pH值為7.0時活性最強，pH 值為5.0和8.5時無抑菌活性(細菌可以在這2個pH值條件下生長，數據本文沒列出)，所以確定最適初始pH 值為7.0。

表2 發酵溫度對產細菌素的影響

表3 初始pH對產細菌素的影響

2.5 裝液量對產細菌素的影響

裝液量對菌株3－2產細菌素的影響的試驗結果如表4所示。當裝樣量達到100 mL后隨著裝液量的增大，抑菌活性呈下降趨勢，所以確定最適裝樣量為100 mL/500 mL。

表4 裝液量對產細菌素的影響

2.6 接種量對產細菌素的影響

接種量對3－2菌株產細菌素的影響的試驗結果如表5所示，當接種量為3%后，發酵液的抑菌活性最強，繼續增大接種量，發酵液活性無顯著變化，考慮實驗的經濟性，選用3%作為最佳接種量。

表5 接種量對產細菌素的影響

2.7 接種齡對產細菌素的影響

接種齡對3－2菌株產細菌素的影響的試驗結果如表6所示。菌株產細菌素水平隨著接種齡的變化而變化，接種齡在12 h的發酵液抑菌活性最強，種齡超過12 h后，發酵液抑菌活性開始下降，所以選用12 h作為種子的發酵時間。

表6 接種齡對產細菌素的影響

3 討論

不同微生物生長情況不同或合成的發酵產物不同，所需的培養基也就有所不同，但是對于所有發酵生產用的培養基的設計也是存在某些共同點可供遵循的，即所有的發酵培養基都必須要有可以提供微生物生長繁殖和產物合成所需要的碳、氮源、無機源、生長因子和水等。對于大規模的發酵生產，除了考慮以上的微生物需要外，還必須考慮培養基原料的價格以及來源。對于3－2菌株發酵培養基的篩選，本試驗通過搖瓶實驗在5種基礎培養基的基礎上篩選最適的培養基，然后再在此最適的培養基的基礎上對其發酵條件進行優化，結果證明不同的培養基組分及配比對枯草芽孢桿菌3－2產細菌素有不同的影響，BPY為最適的培養基。隨著發酵時間的延長細菌素產量也相應的增加，24 h時產量達到最大，繼續發酵產量沒有明顯增加，推測隨著發酵時間的延長培養基內營養物質也相應的降低，阻礙了細菌素的進一步產生。溫度對3－2產細菌素有明顯的影響，溫度過高或過低都不利于其產生細菌素。在中性環境中最易產生細菌素，通氣量對3－2產細菌素也有明顯的影響，通氣量過大或過低都不利于產生細菌素。接種量、種齡對其細菌素的產生有一定的影響。

枯草芽孢桿菌3－2生長快，易產生細菌素，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有很好的抑菌作用，是一株很有潛力開發用于天然防腐劑的菌株。本試驗最終確定了3－2產細菌素的最佳培養基和培養條件，為下一步的研究和開發應用奠定了基礎。

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