IAA處理對擬南芥葉原生質體分離的影響

趙嚴偉，黃志剛，李合松

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

原生質體是重要的生物材料，廣泛地應用于植物學研究的各個方面，如細胞雜交、亞細胞定位、基因瞬時表達、啟動子分析等[1]。但原生質體在分離過程中受到的酶解壓力可能影響其重要的生理狀態，如形態改變、再生能力喪失等[2]。酶解壓力主要由酶解時間和酶濃度造成，時間越長、濃度越高，壓力越大[3]。因此，這對在較小的壓力下得到大量的有活力原生質體具有一定意義，使其能更好地應用于后續研究工作，提高試驗成功率。

植物激素中的IAA可通過激活細胞壁水解酶，加速木葡聚糖的降解[4]，從而有可能減少酶處理的濃度與時間。前人的研究主要集中于原有的分離純化條件中諸因素的優化[3]，或通過施加抗壞血酸（ASA）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等[5]抑制膜損傷來提高原生質體的數量與活力，而對植物激素應用于原生質體分離的研究較少。筆者以擬南芥為材料，主要通過不同濃度的IAA處理擬南芥葉片，探討其對原生質體分離的影響以及IAA處理是否有利于降低酶解壓力，分析最合適的IAA施用濃度、酶解時間與酶濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 哥倫比亞野生型擬南芥（Arabidopsis accessions：Col-0），種子由湖南農業大學植物激素重點實驗室提供。

種子經4℃春化處理3 d，播種于培養基質（營養土∶蛭石=1∶3）中，光照培養箱培養，培養條件為：溫度22℃，光/暗周期12/12 h，濕度70%。取生長35 d叢生葉片的第7、8、9片平展葉為試驗材料。

1.1.2 試 劑 纖維素酶R-10，離析酶R-10，MES，IAA 等。

1.2 方法

1.2.1 IAA處理 在分離原生質體2 h前，對分離材料擬南芥葉片表面噴灑IAA。

1.2.2 原生質體分離 試驗方法基本參照Yoo等[6]的方法，材料鮮重與酶液體積比例為1∶10?；静襟E：將生長狀態良好的擬南芥葉片切成2 mm左右寬度的細絲后立即浸入含1.0%纖維素酶R-10及0.2%離析酶R-10的酶解液中，23℃黑暗靜置4 h，細胞篩過濾，100 g×1 min離心純化2次，棄上清液。每個處理的材料量均為50 mg擬南芥葉片，每個處理3次重復。

1.2.3 細胞計數板計數 計數方法及規則參照郭軍英[7]的方法，中性紅（0.01%）染色鑒定原生質體的活力[8]。

1.3 試驗設計

1.3.1 不同酶解方式下IAA處理對原生質體產量的影響 為探明IAA處理對原生質體分離的影響是否與酶的種類有關，設置了雙酶混合處理與纖維素酶+離析酶、離析酶+纖維素酶兩種單酶依次處理。IAA處理濃度為10-5mol/L。

1.3.2 不同濃度IAA處理對原生質體數量與活力的影響選用L9（34）正交設計實驗（表1），研究纖維素酶R-10濃度、果膠酶R-10濃度與IAA處理濃度對擬南芥葉肉細胞原生質體分離效果的影響。

1.3.3 不同酶解時間下IAA處理對原生質體產量與活力的影響 選用0.6%纖維素酶+0.2%離析酶+10-7mol/L IAA組合作為IAA處理組，比較IAA處理組與對照1（0.6%纖維素酶+0.2%離析酶）及對照2（1.0%纖維素酶+0.2%離析酶）在1～4 h的原生質體產量與活力差異，分析IAA對原生質體分離的作用與酶解時間的關系。

表1 正交因素水平表

2 結果與分析

2.1 不同酶解方式下IAA處理對原生質體產量的影響

從表2看出，不同酶解方式對IAA處理的反應不同。雙酶混合處理下原生質體數量顯著高于單酶依次處理。10-5mol/L IAA處理對原生質體分離有顯著影響，降低了原生質體數量40%左右，只有纖維素酶在前的單酶依次處理中IAA組原生質體數量高于對照組，約是后者的2.4倍。

表2 不同酶解方式下IAA處理對原生質體產量的影響

2.2 不同濃度IAA處理對原生質體數量與活力的影響

如表3、表4所示，IAA濃度對活力原生質體數量有顯著影響，影響程度為IAA濃度＞纖維素酶R-10濃度＞離析酶R-10濃度。雙因素交互作用方差分析表明（數據未顯示）三個因素間無相互作用。表5表明A1B2C2為最佳組合，在正交試驗中，即0.6%纖維素酶+0.2%離析酶+10-7mol/L IAA。A因素間差異不顯著，B因素間差異不顯著，C3與C1和C2有顯著性差異（表5）。

表3 擬南芥原生質體分離正交試驗結果

表4 無相互作用的方差分析表

表5 三因素均數表

2.3 不同酶解時間下IAA處理對原生質體產量與活力的影響

表6表明，IAA處理后的擬南芥葉片能在較少的纖維素酶濃度下（0.6%）得到大量的有活力的原生質體，與對照1相比提高了31.1%（4 h），與正常的對照組2相比，IAA處理組一直保持較高的活力，且在酶解1～3 h后的原生質體數量高于對照2。

表6 不同酶解時間下IAA處理對原生質體產量與活力的影響

3 討論與結論

試驗結果表明，IAA對原生質體分離有較大影響，且對纖維素酶R-10與離析酶R-10的影響不同，在10-5mol/L IAA處理葉片后，纖維素酶先酶解的材料與離析酶先酶解的材料原生質體數量分別比對照組提高了1.4倍和降低了40%左右，表明IAA可能主要對纖維素酶起作用。正交試驗分析表明，0.6%纖維素酶+0.2%離析酶+0.1 μmol/L IAA是較好的酶解組合，能在3 h內獲得大量有活力的原生質體，且在4 h內的活力均高于1.0%纖維素酶+0.2%離析酶組合，同時與未經IAA處理的對照1（0.6%纖維素酶+0.2%離析酶）相比，原生質體數量有較大提高，3 h時差異最大，原生質體數量提高了約1.3倍，表明這種提高是由IAA處理引起的。方差分析發現，IAA濃度對活力原生質體數量有顯著影響，但纖維素酶濃度對其無顯著影響，且三因素間無相互作用，暗示IAA作用的主要目標可能不是外施的纖維素酶，而是激發了細胞壁上本身存在的纖維素酶。

綜上所述，IAA處理可提高酶解反應的速度。合適的IAA處理濃度可在一定程度上減少酶的使用濃度及酶解時間，從而降低酶解壓力，提高原生質體活力。

10-7mol/L的IAA能有效提高活力原生質體數量，而過高的IAA施用濃度可能由于過度激發壁上纖維素酶功能，而造成原生質體的破裂。

[1]Wu F H，Shen S C，Lee L Y，et al.Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method[J].Plant Methods,2009，5（16）：1-10.

[2]Ana L O T，Lisete C D，José E B P P，et al.Protoplast production from napier grass and pearl millet triploid hybrids[J].Scientific Electronic Library Online，2010，34（5）：1219-1223.

[3]喬永旭，張永平，王桂蘭，等.蝴蝶蘭原生質體提取方法的優化[J].植物生理學通訊，2008，44（6）：1177-1180.

[4]Daniel J C.Growth of the plant cell wall[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2005，6：850-861.

[5]傅明輝，莊東紅.抗壞血酸對花生原生質體分離過程中膜損傷的保護作用[J].亞熱帶植物科學，2001，30（3）：7-10.

[6]Sang D Y，Young H C，Jen S，et al.Arabidopsis mesophyll protoplasts：a versatile cell system for transient gene expression analysis[J].Nature Protocols，2007，2（7）：1563-1560.

[7]郭軍英.關于血球計數板的使用及注意事項[J].教學儀器與實驗，2009，（4）：26-28.

[8]Stéphanie R，Jan Z，Clay C，et al.Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf derived protoplasts[J].Nature Protocols，2007，2，259-262.