兩種不同淋巴細胞分離液對臍帶血單核細胞的提取及后期誘導培養CIK細胞的影響

張校通*， 趙令卉，王小燕，王翔，申重陽，鄭榆坤

（成都清科生物科技有限公司，成都，610000）

臍帶血單核細胞是較為常見的一類細胞，用途較為廣泛，內含豐富的造血干細胞、間充質干細胞等，且分離的臍帶血單核細胞經過誘導成為在腫瘤的防治中具有重要作用的CIK（Cytokine-Induced Killer, CIK）細胞。如何保證提取臍血單核細胞的質量，減少對后期細胞培養的影響，成為單核細胞提取過程中共同關注的話題。淋巴細胞分離液的選擇不僅決定著單核細胞分離的效果，而且對后期CIK誘導培養也有著重要的影響。為了在達到理想的分離提取效果以及盡可能節約實驗成本，我們通過使用兩種不同品牌的淋巴細胞分離液，觀察使用兩種不同分離液對臍帶血單核細胞分離效果及對后期培養的影響，為進一步研究臍血來源CIK的生物學特性奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

主要儀器及耗材：離心機（湖南湘麓公司）；生物安全柜（珠海市再鑫儀器有限)；細胞培養箱（三洋公司）；離心管（CORNING）；移液槍（fastpette）；注射器(新葉牌）；移液管（CORNING）；T175培養瓶（CORNING）；普通顯微鏡（奧林巴斯公司）；血球計數板（求精公司）。

主要實驗試劑：PBS（Hyclone）；ficoll淋巴細胞分離液（GE healthcare）；TBD淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物科技有限公司）；細胞培養基（Hyclone）。

1.2 方法

1.2.1 臍帶血單核細胞的提取

接收到經產婦同意采集的四份臍帶血后，將其編為1、2、3、4號，各份血樣平均分成兩份放入離心管內離心，根據液體的量加入兩倍體積生理鹽水混勻。然后分別以1.5∶1的比例緩慢等量加入兩種淋巴細胞分離液然后離心，吸取中間的白細胞層進入離心管，根據吸入液體的量加入PBS，將細胞和PBS混勻、離心。進過兩次PBS洗滌后用移液管吸取棄掉離心管上面的PBS，保留離心管底部的細胞。記錄細胞的密度及活率。

1.2.2 臍帶血單核細胞的誘導培養

把用兩種不同淋巴細胞分離液提取的臍帶血單核細胞分別裝入T175的培養瓶里，然后加入25mL的誘導液，把細胞搖勻后放入37℃二氧化碳濃度5%的培養箱進行誘導培養。在細胞培養期間，根據細胞的生長密度經兩種分離液提取的細胞定期加入或棄掉相同的培養液。在細胞培養的第0、4、8、12、16、20天取樣進行細胞活率及密度的測定。觀察兩種不同培養液提取細胞對后期培養的影響。

1.2.3 細胞密度及活率的測定

（1）密度測定：將血球計數板及蓋片用綢緞布擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板上。將7～10μL細胞懸液滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片及計數板間。靜置1min后鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數。

細胞數/mL = 4大格細胞總數/4×稀釋倍數×10000

（2）活率測定：將細胞懸液0.5 mL加人Ep管中，加入等量的0.4%臺盼蘭染液，染色2～3min。取7～10μL懸液涂于載破片上并加上蓋片，鏡下取任意視野分別計死細胞及活細胞數，計算細胞活率。

細胞活率=活細胞數/ (死細胞數+活細胞數)

2 結果

2.1 兩種分離液的提取效果及比較

臍帶血分別加入兩種不同分離液離心后，管中內容物分為3個清晰的層面：上層為血漿(內含血小板)，中間層為分層液，底層為紅細胞和多形核白細胞[1]。在上層清晰的橙紅色液體與中層清亮透明液體交界處可清楚地見到環狀乳白色的層面，即為臍帶血單核細胞層（如圖1）。GE淋巴細胞分離液分離的細胞數量較多但明顯含有較多紅細胞，而國產TBD淋巴細胞分離液中紅細胞較少。離心洗滌后，可以看到A管中沉淀到底層的紅細胞比B管中紅細胞少很多（如圖2）。顯微鏡觀察結果也表明GE淋巴細胞分離液提取出的臍帶血單核細胞比TBD淋巴細胞分離液提取出的數量較多，但其中含有大量的紅細胞（如圖3）。

圖1 兩種分離液的提取效果

A管為國產TBD牌淋巴細胞分離液分離后的效果；B管為用進口GE healthcare淋巴細胞分離液分離后的效果。

圖2 PBS清洗離心后效果

A管為國產TBD牌淋巴細胞分離液分離提取后經PBS清洗離心得到的效果；B管為用進口GE healthcare淋巴細胞分離液分離提取后經PBS清洗離A是用國產的TBD淋巴細胞分離液提取的結果；B是用進口的GE healthcare淋巴細胞分離液提取的結果。

2.2 單核細胞經誘導培養后CIK細胞的密度及活率

2.2.1 CIK細胞的密度

表1 兩種分離液提取單核細胞的密度

由表1可以看出，用GE淋巴細胞分離液提取的單核細胞數量比用TBD淋巴細胞分離液提取的多。但實驗也表明用GE淋巴細胞分離液提取的單核細胞中紅細胞比較多。在后期的誘導培養中，可以看到兩種方法離細胞的密度逐漸的接近。

2.2.2 CIK細胞的活率

由表2可以看出，用TBD淋巴細胞分離液提取的單核細胞與用GE淋巴細胞分離液提取的單核細胞活率接近，都可以達到90%以上，兩種分離液分離細胞在后期培養中無明顯差別。

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3 討論

臍帶血單核細胞是一種用途非常廣泛的細胞，可以分化為多種細胞，經過誘導成為CIK細胞是一種新型的免疫細胞。與傳統免疫細胞相比，CIK細胞對腫瘤具有更強大的體內外殺傷活性[2]。它主要由CD3+CD56+和CD3+CD8+組成，其兼具T細胞的抗瘤活性和自然殺傷細胞非MHC限制性殺瘤作用。抗瘤性高于淋巴因子激活的殺傷細胞[3]。臨床應用表明CIK細胞對腫瘤患者微小殘留灶有較好療效[4]，在結合抗原呈遞細胞進行腫瘤特異性治療[5]、基因治療[6]等方面有更深入的臨床研究價值。所以，對臍血單核細胞提取的質量要求極為嚴格，本試驗通過比較驗證了不同淋巴細胞分離液對細胞分離效果及對后期培養的影響。試驗結果表明，兩種淋巴細胞分離液的分離效果及后期誘導培養CIK細胞的影響，我們發現國產的TBD淋巴細胞分離液和進口的GE淋巴細胞分離液相比，前者離心后分層更清楚，提取更方便。雖然提出的單核細胞的量要比進口的GE淋巴細胞分離液提出的少一些，但后者里面所摻雜的紅細胞較多，且隨著后期培養二者無論在細胞密度還是活率上都已十分接近，無疑在此實驗中使用TBD分離液比較經濟實惠。

通過實驗，為臍血單核細胞提取實驗中淋巴細胞分離液的選擇提供了參考，并且通過對腫瘤有殺傷作用的CIK細胞的誘導培養驗證了對后期培養的影響，也為腫瘤疾病的預防和治療提供了一定的實驗基礎。

[1]吳鵬，劉映峰，梁東輝，陳允欽.提高人外周血單核細胞分離率的方法探討[J].實用醫學雜志，2008，24(5)：707-708.

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[3]Matsuda K, Tsunoda T, Tanaka H, et al. Enhancement of cytotoxic tlymphocyte responses in patients with gastrointestinal malignancies following vaccination with CEA peptide-pulsed dendritic cells[J]. Cancer Immunology Immunotherapy, 2004,53(7): 609-616.

[4]匡志鵬，梁安民.CIK細胞聯合樹突狀細胞治療惡性腫瘤的研究進展[J].現代腫瘤醫學，2006，14(2)：240-242.

[5]SCHMIDT-WOLF IG, FINKE S, TROJANECK B, et al. Phase I clinical study applying autologous immunological effector cells transfected with the interleukin-2 gene in patients with metastatic renal cancer, colorectal cancer and lymphoma[J]. Br J Cancer,1999, 81(6): 1009-1016.

[6]MARTEN A, RENOTH S, VON LILIENFELD-TOAL M, et al.Enhanced lytic activity of cytokine-induced killer cells against multiple myeloma cells after co-culture with idiotype-pulsed dendritic cells[J]. Haematologica, 2001, 86(10): 1029-1037.