NF-κB decoy寡核苷酸對人結腸癌細胞株SW480/ADM耐藥性的逆轉作用

劉 昕

(中國人民解放軍第316醫院，北京100093)

許多研究已經證實，核轉錄因子κB(NF-κB)與多種疾病相關，是多種信號轉導途徑的匯聚點。腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性是導致腫瘤化療失敗的主要原因，也是亟待解決的臨床難題之一。2010年8月～2011年1月，我們就NF-κB decoy寡核苷酸對結腸癌細胞株的耐藥性逆轉進行了研究。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 人結腸癌細胞耐藥株SW480/阿霉素(ADM)系本實驗室儲存。RPMI 1640培養液購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自GIBCO公司，MTT、DMSO及ECL發光試劑盒購自美國Sigma公司，NF-κB P65抗體及羊抗兔二抗均購自碧云天公司。ADM為日本明治醫藥公司產品;NF-κB decoy ODNs序列為 5＇-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3＇和 3＇-GGAACTTCCCTAAAGGGAGG-5＇，由上海生工合成;Liperfection2000購自invitrigen公司。

1.2 細胞培養及分組 SW480貼壁生長于完全培養基(RPMI1640中含10%小牛血清，青霉素和鏈霉素各50 U/L)中，SW480/ADM于完全培養基中加入0.5 mg/L ADM，并定期添加1 mg/L ADM以維持其耐藥性，兩種細胞均于37℃、5%CO2的飽和濕度箱中培養，隔天換液，對數生長期傳代。細胞分為對照組、SW480組、SW480/ADM組。將各組細胞按3 000個/孔種入96孔板，常規培養，于12、24、48 h時取出。檢測時加入MTT 50μl(1 mg/ml)，培養4 h后，吸去培養液，加入100μl二甲基亞砜，脫色搖床20 min搖勻，在570 nm波長檢測吸光度A值，并計算細胞的半抑制濃度IC50。

1.3 Western blot檢測核內 NF-κB 48 h 后，收集各組細胞，提取細胞核蛋白，SDS-PAGE膠分離，濕法轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(1∶2 500)4℃過夜，TBST漂洗3次后二抗(兔抗羊，1∶2 000)37℃孵育2 h，TBST漂洗后ECL發光。

1.4 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件;計量資料以±s表示，行單因素方差分析;計數資料采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NF-κB decoy的有效性驗證 免疫細胞化學發現NF-κB decoy處理的SW480/ADM細胞核內染色較對照組明顯降低，提示活化 NF-κB減少，與SW480/ADM組相比有統計學差異(P＜0.01)。Western blot同樣證實，經過NF-κB decoy處理后，核蛋白內 NF-κB 明顯減少(P ＜0.01)。證明 NF-κB decoy干預有效。

2.2 NF-κB decoy 逆轉細胞株耐藥性 按文獻［1］將NF-κB decoy質粒轉入細胞后，利用MTT檢測細胞存活率。結果提示，轉染不同質量(濃度)NF-κB decoy質粒后48 h，SW480/ADM的IC50值呈劑量依賴性下降(P＜0.05)。見表1。選取轉染 NF-κB decoy質粒終濃度為 1 μmol/L，在 12、24、48 h 進行檢測，結果提示隨著時間延長，自24 h起，NF-κB decoy對耐藥細胞株的逆轉作用與對照組有統計學差異(P ＜0.05)。見圖1。

表1 不同濃度NF-κB decoy質粒對48 h兩種細胞株的ADM 敏感度(IC50，±s)

表1 不同濃度NF-κB decoy質粒對48 h兩種細胞株的ADM 敏感度(IC50，±s)

mol/L SW480組組別 0 μmol/L 0.1 μmol/L 0.3 μmol/L 1 μ 8.0 ±0.2 7.8 ±2.5 7.1 ±0.9 7.0 ±0.3 SW480/ADM組43.7 ±9.8 37.7 ±6.7 12.2 ±3.9 8.1 ±0.8

圖1 NF-κB decoy不同時間對SW 480/ADM的耐藥性逆轉情況

3 討論

耐藥性又稱抗藥性，系指微生物、寄生蟲以及腫瘤細胞對于藥物作用的耐受性，主要是經長期或反復用藥后特別是濫用藥物后產生。耐藥性一旦產生，藥物的治療作用就明顯下降或消失。因此，研究結腸癌耐藥的相關分子生物學機制，尋找逆轉結腸癌化療耐藥的新方法，已經成為目前結腸癌治療領域的研究重點之一。NF-κB存在于體內多種細胞中，活化后能與許多基因啟動子區域的固定核苷酸序列結合而啟動基因轉錄，參與多種疾病的發病過程，不僅與細胞的增殖、凋亡、生長分化、細胞周期及機體的免疫應答狀態有關，而且還與腫瘤的發生、發展和浸潤轉移有密切關系［2～4］。在腫瘤耐藥方面，目前的研究資料認為，NF-κB活化后可上調腫瘤細胞存活基因的轉錄，使腫瘤細胞逃避化療藥物所引起的死亡效應，從而誘導腫瘤耐藥。NF-κB活性升高是導致結腸癌HT-29細胞多細胞耐藥的重要原因之一，李建軍等［2］的實驗結果提示其機制可能與凋亡相關蛋白的表達調控有關。

由于NF-κB能特異性識別并結合目的基因上的κB序列，利用這個特性，可合成包含κB序列的雙鏈ODNs，將其轉入靶細胞核，可競爭性結合核內激活的NF-κB，使 NF-κB不能發揮作用，這一策略也被稱為decoy。NF-κB decoy寡核苷酸已經在心血管疾病、炎癥性疾病、器官移植和腫瘤［3，4］的治療研究中都取得了令人滿意的結果。與使用NF-κB抑制劑如IKKs或IKBs等比較，NF-κB decoy寡核苷酸靶向性更加明確，抑制效果更加專一。本研究采用NF-κB decoy方法使 NF-κB不能發揮作用，可有效逆轉結腸癌細胞株對ADM的耐藥性。但是值得注意的是，由于NF-κB涉及到多個信號途徑，對腫瘤細胞耐藥性的作用僅為其生理功能的一方面，是否有其他方面的影響尚待下一步實驗繼續驗證。

［1］Yoshizumi T，Ikeda Y，Kanedaand Y.Ex vivo transfer of nuclear factor-κB decoy ameliorates hepatic cold ischemia/reperfusion injury［J］.Transplantation Proceedings，2009，41(5):1504-1507.

［2］李建軍，潘鳳，黃海輝，等.NF-κB信號通路介導結腸癌多胞耐藥的作用研究［J］.解放軍醫學雜志，2008，33(10):1205-1208.

［3］De Stefano D，De Rosa G，Carnuccio R.NF-kappa B decoy oligonucleotides［J］.Curr Opin Mol Ther，2010，12(2):203-213.

［4］Fichtner FS，Fuss IJ，Preiss JC，et al.Treatment ofmurine Th1-and Th2-mediated inflammatory bowel disease with NF-kappa B decoy oligonucleotides［J］.J Clin Invest，2005，115(11):3057-3071.