α-蒎烯促進海洋真菌Aspergillus sp.產真菌毒素青霉酸的研究*

李厚金，謝瑩璐，邱小忠，藍文健

(1. 中山大學化學與化學工程學院，廣東 廣州 510275；2. 南方醫科大學解剖教研室，廣州 510515；3. 中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

軟珊瑚Sarcophytontortuosum在海南三亞珊瑚礁海區分布較廣，采集容易。我們已從該軟珊瑚中分離發現了一系列新的、結構獨特的、具有抗腫瘤活性的四萜化合物methyl sartortuoate，methyl isosartortuoate，methyl tortuoate A-D[1-5]。軟珊瑚體內共附生了大量的微生物，而共附生微生物則是潛在的活性物質的豐富來源。

我們對Sarcophytontortuosum的內生微生物進行了分離培養，得到一批真菌和細菌。對其中的1株內生真菌Aspergillussp.(采集編號SF005)進行了發酵培養，該菌在含葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，100%海水，pH 7.5的培養基(GPY)中，生長良好，能產真菌毒素青霉酸(penicillic acid)，產量為5.5 mg/L。當在GPY培養基中添加200 mg/L的單萜α-蒎烯，能顯著促進該真菌產青霉酸，產量可提高至29.15 mg/L。研究發現該菌能將α-蒎烯轉化成系列氧化產物，并進一步發生氧化降解。該研究結果表明單萜α-蒎烯是一個有效的誘導子，能引起真菌的氧化應激反應，可提高微生物次生代謝物的產量。

圖1 青霉酸的結構式

1 實驗部分

1.1 菌種

真菌Aspergillussp. (菌株編號SF005)，分離自海南三亞西島海域軟珊瑚Sarcophytontortuosum的體內。用PDA(potato/ dextrose/ agar) + 100 %海水為培養基，pH 7.5，4 ℃保存。菌種保藏于中山大學化學與化學工程學院天然產物研究室。

1.2 儀器和試劑

日本島津公司高效液相色譜儀：LC20AT泵，SPD-20A檢測器。分析型色譜柱Inertsil?ODS-SP，5 μm，250 mm×4.6 mm；制備型色譜柱Shim-pack PRC-ODS，15 μm，250 mm×20 mm。美國Finnigan公司TRACE DSQ GC-MS 聯用儀。

α-蒎烯，分析純；乙腈，HPLC級，均購于Sigma公司。乙酸乙酯為市售AR 試劑。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏為生化試劑，購于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

真菌Aspergillussp.發酵的GPY培養基配方為：葡萄糖(10 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母膏(2 g/L)、100 %海水，pH 7.5。

配制20 L GPY培養液，均分成2組，120 ℃滅菌20 min。接入菌種，120 r/min搖瓶室溫培養。待培養至第5 d，在其中1組培養瓶中添加200 mg/L的α-蒎烯，繼續培養15 d。真菌培養液用乙酸乙酯提取3次，提取液經低溫旋轉蒸發濃縮得到2種培養條件下的代謝產物提取物。

配制10 L GPY培養液，均分成10組，滅菌后接入真菌Aspergillussp.，培養至第10天，分別收集菌體，菌體分別在無菌條件下轉接入1 L已稀釋至20%的GPY培養基中，同時添加200 mg α-蒎烯。每隔24 h收取1組真菌的培養液，用乙酸乙酯提取3次，濃縮得到不同時間條件下α-蒎烯的轉化產物提取物。

液相色譜實驗條件：取1 mg提取物，用2 mL乙腈溶解，進樣5 μL。以水和乙腈為洗脫劑，以φ=30%的乙腈洗脫10 min，然后梯度提高乙腈含量，至40 min達100%，并繼續恒定至60 min。

氣質聯用色譜條件：DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。程序升溫：初始溫度80 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至150℃，保持10 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。 進樣口溫度250 ℃，氦氣為載氣，流速為1 mL/min。分流比為30∶1，樣品用氯仿溶解，進樣量1.0 μL。質譜條件：離子源為EI源，離子源、連接口溫度均為230 ℃。

2 結果與討論

2.1 α-蒎烯對真菌Aspergillus sp.產青霉酸的促進作用

真菌Aspergillussp.在GPY培養基中生長迅速，菌絲體呈白色，并能長出小圓粒狀的孢子。其培養液為淺黃色。

10 L GPY培養液提取物為2.28 g，經液相分析，青霉酸為最強峰，保留時間為7.2 min (見圖2a)，經制備分離得到純的青霉酸為55 mg。在添加了α-蒎烯的GPY培養組中，10 L GPY培養液提取物為3.11 g，液相分析其青霉酸的保留時間也為7.2min (見圖2b)，經制備分離得到純的青霉酸為291.5 mg。由此可見，加入α-蒎烯后可以使青霉酸的產量由5.5 提高到29.15 mg/L。

從其HPLC的分析結果還可以看出，在兩種培養條件下，其它代謝產物的組成和含量也具有顯著的不同。在GPY培養條件下，具有結構獨特性的吡嗪類化合物[6]，如3-異丁基-6-(1-羥基-2-甲基-丙基)-2(1H)-吡嗪酮(tR=26.5 min) 和3，6-二異丁基-2(1H)-吡嗪酮(tR=28.2 min)，在添加了α-蒎烯的GPY培養組中并沒有檢測到。

圖2 真菌Aspergillus sp.培養液提取物的高效液相分析結果

2.2 真菌Aspergillus sp.對α-蒎烯的轉化

在α-蒎烯的轉化培養組中，由于采用了稀釋的培養基，有效地去除了代謝產物的干擾。從第1～第10天的轉化提取物的GC-MS分析結果來看(第3天的結果見圖3)，其轉化產物主要為氧化產物(見圖4)。在真菌的作用下，α-蒎烯中的碳碳雙鍵易于發生環氧化；其張力相對較大的四元環也易于開環，形成新的不飽和碳碳雙鍵，或者轉化成羥基或環氧化物。

圖3 真菌Aspergillus sp.對α-蒎烯轉化產物的氣相色譜-質譜總離子流圖

在第1～第10天的結果分析中，仍難以描繪出各種轉化產物的變化途徑。其原因可能是各種轉化反應同時發生的，呈多途徑，并有交叉。另外，轉化變化也是持續的，各種轉化產物都將進一步發生開環、降解，最終生成水溶性的小分子化合物，并有可能被真菌吸收利用。

圖4 α-蒎烯的主要轉化產物

3 結 論

大量報道表明，海洋微生物代謝產物的產生跟培養條件有很大的關系，同一菌株用不同的培養基可以得到完全不同的代謝產物。目前，人們在研究海洋微生物時，究竟該選用何種培養方法，具有很大的主觀性、隨機性，而且，對于具體的微生物菌株在某種培養基里能產生何種結構類型的代謝產物也無法預測。在常規培養條件下，很多微生物活性物質的產量低，而且由于結構復雜，也不易于人工合成，對于拿到足夠的樣品量以滿足藥理與臨床研究，仍有相當困難。因此，深入研究海洋微生物的代謝規律，發展獨特的培養技術，實現可人為調控的結構多樣的有用代謝產物(包括活性物質)的高效生產，已成為海洋微生物代謝產物研究與開發必須解決的關鍵問題。

天然單萜的微生物生物轉化，能得到大量具有高附加值的含氧芳香萜類產品，在日用化工行業應用前景廣闊。然而，此前的研究幾乎全是專注于轉化產物，并未涉及到微生物的代謝產物變化[7-8]。真菌Aspergillussp.在GPY培養基中添加200 mg/L的單萜α-蒎烯，可以使青霉酸的產量由5.5 提高到29.15 mg/L，提高了5.3倍。轉化產物分析發現該菌能將α-蒎烯轉化成系列氧化產物，并進一步發生氧化降解。親脂性單萜可與微生物細胞膜上的磷脂雙分子層作用，可改變細胞膜的結構和功能，是“有毒的”，但由于細胞膜具有動態調節能力，維持膜結構，它能通過膜上酶活性的調節，對萜類進行氧化轉化，進行“解毒”。細胞膜上的酶是復雜多樣的，它們的活性變化，尤其是氧化酶活力的增強，將直接影響到正常的代謝活動，結果必將導致代謝產物的組成和含量改變。本研究結果表明單萜α-蒎烯可以作為一個有效的誘導子，能引起微生物的過敏反應，可提高微生物次生代謝物的產量。

天然單萜，資源極其豐富。微生物培養操作簡單、條件溫和、無毒、環境友好。研究單萜底物對海洋微生物代謝產物的調控機制，并最終實現可人為調控的有用物質的高效率可持續性規模化生產，也為豐富的天然單萜資源的開發與利用提供新的途徑和方法，無疑具有廣闊的基礎理論研究和應用前景。

參考文獻：

[1]蘇鏡娛, 龍康侯, 彭唐生, 等. 中國軟珊瑚化學成分的研究 12.一種新穎獨特的四萜酯——扭曲肉芝甲酯的結構測定[J]. 化學學報,1985, 43(8): 796 - 797.

[2]SU J Y, LONG K H, PENG T S, et al. The structure of methyl isosartortuoate, a novel tetracyclic tetraterpenoid from the soft coralSarcophytontortuosum[J]. Journal of the American Chemical Society, 1986, 108(1): 177 - 178.

[3]ZENG L M, LAN W J, SU J Y, et al. Two new cytotoxic tetracyclic tetraterpenoids from the soft coralSarcophytontortuosum[J]. Journal of Natural Products,2004, 67(11): 1915 - 1918.

[4]LAN W J, LI H J, YAN S J, et al. New tetraterpenoid from the soft coralSarcophytontortuosum[J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2007, 9(3): 267 - 271.

[5]LAN W J, WANG S L, LI H J. Additional new tetracyclic tetraterpenoid, methyl tortuoate D from soft coralSarcophytontortuosum[J]. Natural Product Communications, 2009, 4(9): 1193 - 1196.

[6]LI H J, CAI Y T, CHEN Y Y, et al. Metabolites of marine fungusAspergillussp. collected from soft coralSarcophytontortuosum[J]. Chemical Research in Chinese Universities, 2010, 26 (3): 415 - 419.

[7]藍文健，李厚金，蔡創華，等. 海洋細菌Aeromonashydrophila和Vibriovulnificus對單萜檸檬烯的生物轉化產物分析 [J]. 中山大學學報: 自然科學版, 2006, 45(2): 126 - 128.

[8]李厚金，藍文健，蔡創華，等. 海洋細菌對檸檬烯的生物轉化及萜類產物鑒定 [J].分析化學， 2006, 34(7): 946 - 950.