雞血藤提取物中縮合鞣質的含量測定及其抗腫瘤活性初步研究*

程 悅，符 影，王志宇，楊得坡，陳建萍，王冬梅

(1.中山大學藥學院，廣東 廣州 510006；2.香港大學中醫(yī)藥學院，香港)

雞血藤為豆科密花豆屬植物密花豆SpatholobussuberectusDunn.的干燥藤莖。中醫(yī)認為其具有補血、活血、通絡之功效，臨床上常用雞血藤治療貧血、各種原因(如放療、化療)引起的白細胞、血小板、紅細胞等全血象減少和再生障礙性貧血等疾病，具有較好的療效[1]。此外，現(xiàn)代藥理學研究證明，它還有抗腫瘤、抗病毒、免疫調節(jié)、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜催眠等作用[2]。迄今為止，從雞血藤中發(fā)現(xiàn)的化合物結構類型主要有黃酮類、萜類、甾醇類、蒽醌類、內酯類、揮發(fā)油類等類型的化合物，近年來，對雞血藤的化學成分研究主要集中在黃酮類化合物[3-11]，而其他結構類型的化合物研究較少。

經(jīng)過對雞血藤/φ=60%醇提物化學成分系統(tǒng)預試試驗，發(fā)現(xiàn)除黃酮類、萜類、蒽醌及其苷、香豆素及其苷、酚類化合物的系統(tǒng)預試結果為陽性外，縮合鞣質的特征反應結果也為陽性，但已有文獻中并無任何關于雞血藤中含有縮合鞣質類成分的報道。

縮合鞣質，又稱為原花青素，是一類廣泛存在于植物界的多酚類物質。縮合鞣質由兒茶素或沒食子酸兒茶素等黃烷-3-醇類化合物以碳-碳鍵聚合而形成的化合物，通常三聚體以上才具有鞣質的性質，根據(jù)其黃烷-3-醇結構的差別分為procyanidins和prodelphinins。縮合鞣質具有多種顯著的生物活性，其抗氧化和抗癌活性的研究已備受關注[12]。

故本論文對雞血藤/φ=60%醇提物及其不同極性溶劑萃取部位中的縮合鞣質及總黃酮含量進行測定，同時考察了各萃取物對腫瘤細胞增殖的抑制活性，可對雞血藤抗腫瘤活性部位的制備提供科學依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 供試材料

雞血藤藥材，產(chǎn)地廣西，購自香港大學中醫(yī)藥學院臨床教研中心大藥房，經(jīng)中山大學藥學院生藥學與天然藥化實驗室楊得坡教授鑒定為豆科密花豆屬植物密花豆(SpatholobussuberectusDunn)的藤莖。

1.2 實驗試劑與儀器

TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀ELK-800型(Bio-Tek)，倒置顯微鏡(TS100F，日本NIKON公司)，HPLC色譜儀： LC-20AB泵、SIL-20A自動進樣器、SPD-M20A 二極管陣列檢測器(日本島津公司)，Ultimate AQ-C18色譜柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm，美國Welch公司)，Millipore超純水系統(tǒng)，通用水套CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

DMEM培養(yǎng)基、1640 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)，胎牛血清(FBS)(美國Hyclone 公司)，四甲基噻唑藍(MTT)、dm5825抗生素(青、鏈霉素)、兒茶素均購自美國Sigma 公司，芒柄花素(w> 99%，HPLC，西安慈緣生化科技有限公司)，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、甲醇、硫酸、香草醛為國產(chǎn)分析純試劑。人乳腺癌細胞MCF-7和人結腸癌細胞HT-29均由香港大學中醫(yī)藥學院提供。

2 方法與結果

2.1 雞血藤/醇提物及其各萃取部位的制備

將雞血藤藥材1.5 kg，經(jīng)粉碎后，加入10倍φ=60%乙醇超聲提取2次，每次1 h，減壓回收溶劑后，得到雞血藤/φ=60%醇提物(以下簡稱醇提物)約195 g。稱取180 g醇提物均勻分散于適量的水溶液中，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得石油醚萃取物、乙酸乙酯不溶物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物和水層留余物，其結果如表1所示。

表1 雞血藤醇提物各萃取部位的收率

2.2 雞血藤醇提物及各萃取部位對腫瘤細胞增殖的抑制活性

采用噻唑蘭(MTT)法測定雞血藤醇提物及各個萃取部位對腫瘤細胞增殖的抑制活性。人結腸癌細胞HT-29培養(yǎng)在含RPMI1640培養(yǎng)液中(含100 mL/L加熱滅活胎牛血清，青霉素，鏈霉素各10×105U/L)，人乳腺癌細胞MCF-7培養(yǎng)在含DMEM培養(yǎng)液中(含100 mL/L加熱滅活胎牛血清，青霉素，鏈霉素各10×105U/L)，培養(yǎng)條件為37 ℃，φ=5% CO2，2～3 d換液1次。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

分別取對數(shù)生長期的各細胞每孔100 μL接種于96孔板，細胞濃度為5×104/mL，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，換無血清培養(yǎng)基，24 h后吸除舊培養(yǎng)基，再分別加入90 μL無血清培養(yǎng)基和10 μL 500 μg/mL的藥液(含0.2% DMSO)，使藥液終濃度為50 μg/mL；空白對照組加入10 μL含0.2% DMSO的磷酸鹽緩沖液，每組設6個平行孔，置于37 ℃、φ=5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。之后加入10 μL的5 mg/mL的MTT溶液，再培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加150 μL DMSO，輕輕振蕩15 min，待完全溶解顯色后，用酶聯(lián)免疫檢測儀于540 nm波長下測每孔的吸光度A值，按照如下公式求出增殖抑制率，結果如表2所示。

抑制率=[(對照組平均A值-藥物組平均A值) /對照組平均A值]×100 %

表2 雞血藤/醇提物及各萃取部位對HT-29和MCF-7細胞增殖的抑制活性

2.3 雞血藤醇提物及各萃取部位的高效液相色譜分析

以乙腈和水為流動相，乙腈濃度(φ)10%(0 min)-15%(10 min)-30%(35 min)-60%(45 min)-90%(60 min)-90%(70 min)；流速1 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長250 nm；結果如圖1所示。雞血藤/醇提物、乙酸乙酯不溶物、正丁醇萃取物有明顯的“包峰”，表明其中可能含有大分子物質。

圖1 雞血藤醇提物及各萃取物的HPLC分析圖譜(250 nm)

2.4 雞血藤醇提物及各萃取部位總黃酮含量測定

由于雞血藤中黃酮類化合物以芒柄花素的含量較高，故以其作為雞血藤總黃酮含量測定的指標成分。在一定濃度范圍內，芒柄花素的濃度與其最大吸收波長處的吸光度成正比，可以通過吸光度的測定來計算雞血藤樣品中總黃酮的濃度。由于雞血藤/石油醚萃取物的收率很低且其對腫瘤細胞增殖抑制活性很弱，故不對其進行總黃酮和鞣質的含量測定。

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取芒柄花素對照品5.2 mg，用少量φ=95%乙醇溶解后置25 mL容量瓶中，并用φ=95%乙醇稀釋至刻度，搖勻作為對照品儲備液(0.208 mg/mL)。

2.4.2 檢測波長的確定 將對照品溶液在200～800 nm范圍進行掃描，在250 nm波長處有最大吸收，故選用250 nm作為測定波長。

2.4.3 供試品溶液的制備及測定 精密稱取醇提取物和各萃取物樣品各約1 mg， 置10 mL容量瓶中，加入φ=95% 乙醇 1 mL，超聲溶解，用φ=95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得供試液，用紫外分光光度法測定供試品溶液的A250，計算其中總黃酮的含量。

2.4.4 含量測定的方法學考察

1) 標準曲線和線性范圍。

精密量取上述對照品儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL分別置于10 mL容量瓶中，分別加入φ=95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，在250 nm處測定吸收度。以對照品吸光度A250(Y)為縱坐標，以對照品溶液的濃度(X，μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，總黃酮濃度在2.08～10.40 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=0.116 9X+0.146 4，R2=0.999 9。

2)精密度試驗。

精密吸取對照品儲備液0.3 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入φ=95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，連續(xù)測定6次A250， RSD為0.20%，表明儀器精密度良好。

3)重復性試驗。

分別精密稱取1 mg雞血藤醇提物 6份，按照2.4.3項下制備供試液樣品6份并分別測定A250，計算總黃酮含量均值為6.58%，RSD為1.69%，表明該方法重復性良好。

4)穩(wěn)定性試驗。

精密稱取1 mg雞血藤醇提物，按照2.4.3項下制備供試液樣品，同一供試液分別于第0、1、2、4、8、16 h進行測定A250，共測定6次，RSD為0.65%，表明樣品溶液在16 h內穩(wěn)定性良好。

5)加樣回收率試驗。

稱取0.5 mg已知總黃酮含量的雞血藤醇提取物9份，分別加入相當于其含量120%(高濃度)、100%(中濃度)、80%(低濃度)的芒柄花素對照品溶液，每個濃度平行3份，按照2.4.3項下制備供試液樣品9份，并分別測定A250，結果如表3所示，加樣回收率為101.26%，RSD值為1.40%，表明該方法的準確度良好。

表3 總黃酮含量測定的加樣回收率試驗

2.4.5 雞血藤醇提物及各萃取部位中總黃酮的含量測定 分別稱取雞血藤醇提物、乙酸乙酯不溶物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物各3份，按照2.4.3項下制備供試液樣品溶液，并分別測定A250，計算其中的總黃酮含量，結果顯示，雞血藤/醇提物、乙酸乙酯不溶物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物的總黃酮含量分別為(6.49±1.99)%、(7.36±0.13)%、(9.35±0.22)%、(8.41±0.27)%、(4.48±1.53)%。

2.5 雞血藤醇提物及各萃取部位縮合鞣質含量測定

采用香草醛硫酸法，酸性條件下，縮合鞣質A 環(huán)的化學活性較高，其上的間苯二酚或間苯三酚可與香草醛發(fā)生縮合，產(chǎn)物在濃酸作用下形成有色的正碳離子。采用分光光度法測其吸光度，根據(jù)標準曲線即可得到樣品中縮合鞣質含量，硫酸作為反應過程的催化劑[13]。經(jīng)過顯色反應條件優(yōu)化試驗，最終確定香草醛甲醇溶液的體積濃度為3%，濃硫酸甲醇溶液的體積濃度為30%，避光顯色20 min為反應條件。

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取兒茶素對照品52.59 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，為對照品貯備液(1.051 8 mg/mL)。

2.5.2 供試品溶液的制備 稱取醇提取物和各萃取物樣品各約2 mg，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇，超聲溶解后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，為供試品溶液。

2.5.3 縮合鞣質含量測定方法 取供試品溶液0.5 mL，加入包有錫箔的試管中，分別加入2.5 mLφ=3%香草醛甲醇溶液和2.5 mLφ=30%濃硫酸甲醇溶液，搖勻，避光顯色20 min后，在500 nm處測定吸光度A500。

2.5.4 縮合鞣質含量測定的方法學考察

1) 標準曲線和線性范圍。

精密量取兒茶素對照品貯備液1、2、3、4、5 mL分別置于10 mL容量瓶中，分別加入甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，備用。分別取上述各濃度對照品溶液0.5 mL，按照2.5.3項下測定，以對照品溶液的濃度(X，mg/mL)為橫坐標，吸光度值A500(Y)為縱坐標，進行回歸分析。結果顯示，兒茶素對照品濃度在0.105 2～0.525 9 mg/mL范圍內與吸光度的線性關系良好，回歸方程為Y=2.282 8X-0.119 9，R2=0.999 3。

2)精密度試驗。

取對照品溶液0.5 mL，按照2.5.3項下測定，連續(xù)測定6次A500，RSD為0.19%，表明儀器精密度良好。

3)重復性試驗。

精密稱取2 mg雞血藤醇提取物6份，按照2.5.2項下制備供試液，按照2.5.3項下測定A500，計算縮合鞣質含量均值為51.71%，RSD為2.06%，表明該方法重復性良好。

4)穩(wěn)定性試驗。

精密稱取雞血藤醇提取物2 mg，按照2.5.2項下制備供試液，同一供試品溶液分別于第0、1、2、4、8、16 h按照2.5.3項下測定A500，共測定6次，RSD為3.12%，表明樣品溶液在16 h內穩(wěn)定性良好。

5)加樣回收率試驗。

稱取1.2 mg已知縮合鞣質含量的雞血藤醇提取物9份，分別加入相當于其含量120%(高濃度)、100%(中濃度)、80%(低濃度)的兒茶素對照品溶液，每個濃度平行3份，按照2.5.2項下制備供試液樣品9份，按照2.5.3項下測定A500，結果如表4所示，兒茶素的加樣回收率為99.93%，RSD值為1.86%，表明該方法的準確度良好。

表4 縮合鞣質含量測定的加樣回收率試驗

2.5.5 雞血藤醇提物及各萃取部位中縮合鞣質的含量測定 分別稱取雞血藤醇提物、乙酸乙酯不溶物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物各3份，按照2.5.2項下制備供試液樣品，按照2.5.3項下測定A500，結果顯示，0.6 mg/mL雞血藤醇提物、乙酸乙酯不溶物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物的縮合鞣質含量分別為(51.09±0.37)%、(52.34±4.73)%、(73.22±2.72)%、(83.11±5.87)%、(29.74±2.12)%。

3 討 論

由于縮合鞣質分子中含有較多的酚羥基，性質活潑，不穩(wěn)定，容易氧化，形成極性更大聚合度更高的復雜多聚體，與其他天然產(chǎn)物相比，分離鑒定都有較大難度，其化學結構和組成復雜，但卻有良好的生物活性。本論文首次報道中藥雞血藤中含有大量縮合鞣質類化合物，并對雞血藤醇提物及各萃取部位的縮合鞣質和總黃酮含量進行了測定。

3.1 雞血藤醇提物及各萃取物的總黃酮和縮合鞣質含量的差異

雞血藤醇提物中，總黃酮含量為(6.49±1.99)%，縮合鞣質含量為(51.09±0.37)%，縮合鞣質的含量遠遠高于總黃酮。在各萃取部位中，總黃酮含量大小順序為乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯不溶物>水層留余物，縮合鞣質含量的大小順序為正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>乙酸乙酯不溶物>水層留余物。可知總黃酮及縮合鞣質均在正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物中含量較高，其次是乙酸乙酯不溶物，說明經(jīng)過萃取，雞血藤中的黃酮類化合物和縮合鞣質得到了一定程度的富集。

3.2 雞血藤抗腫瘤物質基礎的研究

雞血藤化學成分復雜，藥理作用多樣，多年來對其研究主要圍繞雞血藤刺激骨髓造血功能，對其抗腫瘤活性研究較少，近年來有文章報道雞血藤粗提物及其黃酮分離產(chǎn)物SSCE在細胞水平和整體動物水平都表現(xiàn)出抗腫瘤活性[14-16]，具體的作用機制至今仍未被闡明，物質基礎亦不明確。本論文研究結果顯示，雞血藤/醇提物及各萃取物對兩種腫瘤細胞的增殖均有一定程度的抑制活性，對MCF-7的抑制活性高于HT-29，其中正丁醇萃取物濃度為50 μg/mL時對MCF-7腫瘤細胞增殖的抑制活性明顯高于其它萃取物，抑制率為77.08%，且其縮合鞣質含量高達83.11%，說明除了黃酮類化合物之外，縮合鞣質也可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的藥效物質基礎。正丁醇萃取物總黃酮和縮合鞣質含量均較高，且對腫瘤細胞增殖抑制作用強，可作為雞血藤抗腫瘤的有效部位，為下一步抗腫瘤活性單體的獲得提供了指導。

3.3 雞血藤質量控制方法的研究

目前對雞血藤藥效物質基礎的研究尚很薄弱，而藥典中對雞血藤的質量控制，只關注了芒柄花素單一化合物，因此雞血藤藥材現(xiàn)有的質量控制方法有著很大的局限性。本實驗發(fā)現(xiàn)雞血藤中縮合鞣質含量遠高于其它類型化合物，同時，黃酮類成分被認為是雞血藤的活性成分[2]，因此本文通過建立雞血藤中的總黃酮和縮合鞣質的含量測定方法，可為雞血藤藥材的質量控制提供一定的參考和依據(jù)。

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