華南地區(qū)漢族人群MDR1基因單核苷酸多態(tài)性研究*

于冰筠， 胡麗莉

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275;2. 廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

多藥耐藥基因1(multiple drug resistance 1，MDR1)定位于人類第7號染色體長臂( 7q21.1)，其編碼的P-糖蛋白(P-glycoprotein,，P-gp)由1 280個氨基酸組成，相對分子量質(zhì)為170 000，是由單一多肽鏈相連接的兩個相似結(jié)構(gòu)域組成，每個結(jié)構(gòu)域均包含6個跨膜a螺旋區(qū)和一個ATP結(jié)合區(qū)。P-gp能夠利用ATP水解釋放能量，主動將細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上的物質(zhì)泵出細(xì)胞[1]。P-gp的生理作用是保護(hù)細(xì)胞免受毒物或代謝物的損害，同時P-gp轉(zhuǎn)運的底物還包括許多藥物[2]，因此，MDR1基因產(chǎn)物的表達(dá)程度和功能可直接影響這些藥物的治療效果。單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism, SNP)是人類遺傳變異中最常見的一種，由于其具有密度高，遺傳穩(wěn)定以及易于實現(xiàn)分析自動化的特點，SNP被認(rèn)為是繼限制性片段長度多態(tài)性和微衛(wèi)星多態(tài)性之后的第三代遺傳標(biāo)記而得以廣泛應(yīng)用，在疾病特別是惡性腫瘤等多基因疾病研究中顯示出巨大的優(yōu)勢。單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點的分布具有明顯的種族和地區(qū)差異[3]，不同個體中MDR1基因多態(tài)性與P-gp表達(dá)和功能的改變密切相關(guān)[4]。最新研究也表明MDR1多態(tài)性基因型與腫瘤的易感性、抗腫瘤藥物治療效果以及生存復(fù)發(fā)等預(yù)后密切相關(guān)[5-6]。本研究采用PCR-RELP和PCR-SSCP方法對華南地區(qū)漢族人群MDR1基因編碼區(qū)及部分啟動子區(qū)SNPs位點進(jìn)行基因分型，并比較不同人種間等位基因頻率的差異，為進(jìn)一步研究華南地區(qū)漢族人群MDR1基因SNP與藥物效果、藥物毒副作用以及疾病易感性之間的相關(guān)性提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象

選擇華南地區(qū)無腫瘤病史、無親緣關(guān)系的漢族健康獻(xiàn)血者244例和體檢者268例，其中男性296例，年齡19～78歲；女性216例，年齡18～97歲，總平均年齡(44.03 ±0.72)歲。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和PCR擴(kuò)增 采用酚-氯仿方法提取外周血基因組DNA。利用primer premier5.0和在線引物設(shè)計工具primer3.0 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)，針對目的片段設(shè)計相應(yīng)的引物(引物序列、產(chǎn)物大小和退火溫度表略)，擴(kuò)增片段長度在300 bp以下。將20 μL PCR反應(yīng)體系(2 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L引物，0.5 U TaqDNA聚合酶，20 ng模板DNA，加滅菌的ddH2O至20 μL)混勻離心后置于PCR儀擴(kuò)增。PCR步驟：① 95 ℃ 4 min；②95 ℃ 1 min，退火溫度54～60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán);③ 72 ℃ 6 min。取3 μL PCR產(chǎn)物在w=0.8%瓊脂糖凝膠、0.5×TBE緩沖液，100 V恒壓下電泳30 min，紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和擴(kuò)增效率。

1.2.2 限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析MDR1基因C3435T(rs1045642，exon26)位點用PCR-RFLP方法進(jìn)行基因分型，10 μL酶切體系(10×buffer 1 μL，ddH2O 6 μL，限制性內(nèi)切酶MboI (Fermantas) 1 U，DNA產(chǎn)物3 μL)混勻后37 ℃水浴過夜。取5 μL的酶切產(chǎn)物和1 μL的6 ×Loading Buffer混勻, 加樣于w=1.2%瓊脂糖凝膠上樣孔中，電壓90 V，室溫電泳50 min。紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析 將2 μL的PCR產(chǎn)物與8 μL的甲酰胺加樣緩沖液 (w=95%去離子化甲酰胺, 20 mmol/L EDTA,w=0.05%二甲苯青和溴酚藍(lán)) 混勻；95 ℃變性8 min后置于冰上；加4 μL樣于w=8%～10%的聚丙稀酰胺凝膠上樣孔中；4 ℃電泳(恒功率4 W 4～6 h)后銀染顯帶。切下SSCP 膠上有泳動異常的條帶，ddH2O溶解后置于50 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用w=1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離、DNA凝膠回收試劑盒(U-gene)回收DNA并貯存于-20 ℃冰箱；樣品由上海博亞公司測序。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用直接計數(shù)法計算華南地區(qū)漢族健康人群MDR1基因各SNPs位點的基因型頻率，根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律直接計算各多態(tài)位點在華南地區(qū)漢族人群中的預(yù)期基因型頻率，運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行χ2檢驗，比較觀察基因型頻率與預(yù)期基因型頻率之間以及不同人群等位基因頻率之間的差異。P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MDR1基因外顯子區(qū)及部分啟動子區(qū)SNPs系統(tǒng)篩選

針對MDR1基因28個外顯子及部分啟動子區(qū)域設(shè)計引物，用PCR-SSCP或者PCR-RFLP方法先在192個正常人樣品中進(jìn)行SNPs的系統(tǒng)篩選，共檢測到5個多態(tài)位點。其中一個位于啟動子區(qū)(圖1)，一個位于第1外顯子的非編碼區(qū)(圖2)，這兩個SNPs都只有T/T純合和T/C雜合兩種基因型，而未檢測出C/C純合型。另兩個SNPs是同義多態(tài)，分別位于第12和第26外顯子(圖3，4)，都是從C到T等位基因的變化，但并沒有改變相應(yīng)氨基酸的序列。另一個SNP位于第21外顯子(圖5)，是由G、T、A三個等位基因組成的多態(tài)，其編碼的893位氨基酸從纈氨酸(Val)變成蘇氨酸(Thr)或絲氨酸(Ser)。其余24個外顯子未檢測出單核苷酸多態(tài)(圖略)。

圖1 MDR1 基因啟動子區(qū)T-2410C位多態(tài)檢測圖

圖2 MDR1 基因第1外顯子T-129C位多態(tài)檢測圖

圖3 MDR1基因第12外顯子C-1236T位多態(tài)檢測圖

圖4 MDR1 基因第26外顯子C3435T位多態(tài)限制性酶切電泳圖

圖5 MDR1基因第21外顯子G2677T/A位多態(tài)檢測圖

我們將上述5個SNPs位點的檢測樣品數(shù)增至512個，得到這5個多態(tài)等位基因在華南地區(qū)漢族人群中的分布頻率(表1)。用χ2檢驗這5個多態(tài)位點基因型的觀察值與預(yù)期值，發(fā)現(xiàn)無顯著差異(P> 0.05)，說明這5個多態(tài)位點的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2 MDR1基因SNPs在不同人種中的分布

為了分析上述5個SNPs在不同人種中分布頻率的差異性，我們將華南地區(qū)漢族人群與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的其他不同人群中的等位基因分布頻率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)除了T-2410C以外，其它位點等位基因的分布都存在顯著的種族差異。T-2410C位點目前只有一篇文獻(xiàn)報道認(rèn)為-2410C等位基因在日本人群中的分布頻率為10% (N= 25)[7]，這與我們的結(jié)果5% (N= 512) 沒有顯著差異(P= 0.099)。

表1 MDR1基因上檢測到的多態(tài)位點及其在華南地區(qū)人群中的分布頻率

1)后4個多態(tài)所在位置以cDNA序列M14758(GenBank)為準(zhǔn)，翻譯起始位點ATG的A作為+1位，MDR1基因翻譯起始位點在第2外顯子，-2410 T/C位置的確定是計算了內(nèi)含子1的核苷酸數(shù)目；2) 等位基因頻率與第一列等位基因所示順序相對應(yīng)。

比較華南地區(qū)漢族人群與已報道的其它地區(qū)中國人MDR1基因多態(tài)的分布頻率發(fā)現(xiàn)[8-15]，除了Tang et al.(2002)報道的G2677T/A位，B. Chowbay et al.(2005)報道的C1236T和C3435T位以外，其余報道的中國人4個位點的分布頻率與我們的結(jié)果均無顯著差異。

為了更簡潔明了地分析MDR1基因各多態(tài)在不同人種中的分布特點，我們根據(jù)等位基因分布頻率接近程度以及地域臨近等因素，將中國(不包括我們的結(jié)果)、日本、韓國和馬來西亞人合并稱為“東亞人群(East Asian)”[8-20]；非籍美國人，加納人，肯尼亞人，蘇丹人合并稱為“非洲人群(African)”[9, 12, 19, 21-23]；英國，德國，波蘭，意大利，西班牙，葡萄牙，俄國等地方的高加索人統(tǒng)稱為“高加索人群(Caucasian)”[ 9, 12, 19, 21-22, 24-28]，印度地處南亞，加上基因型頻率與東亞國家人群的分布頻率差異顯著[8-10, 13, 23]，因此沒有與東亞歸在一起而單獨作為一類人群(圖6)。

圖6 MDR1基因多態(tài)在不同人群之間的分布

結(jié)果顯示非洲人群與其它人群差別最為顯著，1236T，2677T，3435T在非洲人群中的分布頻率明顯小于其它人群，-129T的頻率也較其它人群低。高加索人群與東亞人群除了T-129C位點以外其余等位基因的分布頻率均有顯著差異，高加索人群1236T等位基因的頻率(0.425)比東亞人群(0.640)低，而2677T，2677G和3435T分布頻率均較東亞高，但他們之間的差別不如與非洲人群的差別明顯。印度人群各等位基因分布與東亞和其它人群也均有顯著差異(P< 0.05)，-129T，2677T和3435T等位基因頻率均較高?？傊?個位點在四類人群中的分布均差異顯著。

3 討 論

在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNPs既可能在基因序列內(nèi)，也可能在基因外的非編碼區(qū)序列。但是位于編碼區(qū)的SNP(cSNPs)比較少，因為在外顯子內(nèi)，其變異率僅為周圍序列的1/5，盡管如此，cSNPs在遺傳疾病的研究中卻有重要意義，其研究也更受關(guān)注。2000年，Hoffmeyer S[25]等首次通過DNA全測序?qū)?88個高加索人MDR1基因多態(tài)進(jìn)行了系統(tǒng)的篩查，共發(fā)現(xiàn)了15個SNPs，其中位于第26號外顯子的同義突變C3435T與十二指腸P-gp的表達(dá)水平有關(guān)并影響腸道對地高辛的吸收。之后，MDR1基因的SNPs篩選工作已在不同人群中展開，到目前為止，在MDR1基因的編碼區(qū)與非編碼區(qū)已發(fā)現(xiàn)50多個SNPs，但是仍未見報道在中國漢族人群中系統(tǒng)篩查MDR1基因編碼區(qū)的SNPs。中國民族眾多，地域差異大，我們立足于中國本土華南地區(qū)漢族人群的MDR1基因外顯子區(qū)SNPs的系統(tǒng)篩查，進(jìn)一步完善了中華民族的SNPs譜。

據(jù)報道MDR1 功能相關(guān)的SNPs有T-129C，C1236T，G2677T/A以及C3435T, 雖然目前的報道結(jié)果不大一致，但依舊證明它們與蛋白質(zhì)的表達(dá)量、活性有關(guān)，進(jìn)而影響疾病的易感性和預(yù)后。MDR1多態(tài)性導(dǎo)致的P-gp蛋白表達(dá)水平及活性改變，既會影響有毒物質(zhì)甚至致癌物的排出而與腫瘤發(fā)生相關(guān)，又會因過多的泵出抗癌藥物而致腫瘤細(xì)胞耐藥性。其中MDR1 C3435T位點研究得最多，它雖然是一個同義多態(tài)，但已有相當(dāng)多的文獻(xiàn)報道它與P-gp蛋白的表達(dá)和功能相關(guān)，其作用機理可能是: ①發(fā)生多態(tài)后的亮氨酸密碼子是稀有密碼子，通過影響翻譯效率來影響P-gp蛋白的表達(dá)；②單個核苷酸的改變影響mRNA的折疊，從而影響RNA的剪接；③與其它功能多態(tài)連鎖不平衡，真正作用的是其它位點，它只是起到指示作用。我們研究華南漢族人MDR1基因SNPs分布，可為疾病的發(fā)病機理研究，疾病的診斷及治療提供寶貴的資料。

我們在MDR1編碼區(qū)只篩查出4個SNPs，都是已報道的等位基因分布頻率較高的位點(> 5%)。另外還有一些已報道的位于外顯子上的多態(tài)在華南地區(qū)人群中并沒有檢測到[29]，這些位點大多數(shù)只有在高加索人種中有報道，且等位基因頻率相對較低。我們未能檢測到這些多態(tài)可能是由于它們在人種間分布差異造成的。

比較華南地區(qū)漢族人群與已報道的中國人群中各位點的等位基因分布頻率，發(fā)現(xiàn)只有Tang et al[9]報道的G2677T/A位、Chowbay B et al[10]報道的C1236T和C3435T位與我們的結(jié)果有差異。有趣的是這些與我們有顯著差異報道的人群都是新加坡中國人，而另外一些新加坡中國人4個SNPs的分布頻率與我們的結(jié)果都無顯著差異[11]。新加坡是一個多民族居住的國家，樣品的多樣性可能導(dǎo)致等位基因分布頻率的差異，所以上述新加坡中國人等位基因分布頻率的差異可能是由樣品選擇的差異造成的。另外，MDR1 SNPs在中國本土人群中的分布與我們的結(jié)果無顯著差異[12-15]，這說明我們的結(jié)果具有代表性。

進(jìn)一步比較不同人種之間SNPs分布的差別，發(fā)現(xiàn)MDR1 T-129C在各人種中的分布差別很小，除了日本和美籍黑人以外，其他各人群不僅與我們的結(jié)果無顯著差異，它們之間比較亦無顯著差異。這可能是由于-129C等位基因在各人種中分布頻率都較小(2%～8%)的緣故，而且到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)-129CC純合型基因型，只有-129TT純合型和-129CT雜合型兩種基因型形式，這也降低了其在不同人群眾分布的多樣性。與此同時，MDR1 G2677T/A在各人種中形成非常多樣化的分布，不僅東亞、高加索和非洲人群之間有顯著差異，在東亞和高加索人群內(nèi)部，不同國家差異也十分顯著。這可能是因為它是由三個等位基因組成的多態(tài)，基因型形式存在多種排列組合，使得等位基因的分布頻率更加多樣性。

綜合4個MDR1 SNPs在不同人群中的分布，發(fā)現(xiàn)非洲人群等位基因分布頻率與東亞和高加索人群相差很大，東亞和高加索人群雖也有較大的差別，但相對于非洲人群來說又小一些，這一結(jié)果與人類進(jìn)化的理論一致，即非洲的黑人人種與歐洲或美洲的高加索人種和亞洲的蒙古人種是在10萬年前就分開了，而東亞和高加索人群是在4萬年前才分開的[30]。這些結(jié)果提示我們可以從遺傳學(xué)角度來考慮為什么不同疾病會在不同人群中高發(fā)。

同時，我們還發(fā)現(xiàn)印度等位基因分布頻率與其他人群也有很大差異，不能簡單劃分到“東亞”、“非洲”以及“高加索”人群中的任何一個?？梢姡粌H地理因素影響基因型分布，人種的差別是更重要的因素。印度境內(nèi)有10種以上的民族，人種分布復(fù)雜，而參考文獻(xiàn)中并沒提到所檢測的印度人群確切屬于哪個人種， 推測這是印度人群與東亞人群及其它人群的基因型分布有區(qū)別的原因之一。

人類基因組單核苷酸多態(tài)性研究所揭示的人種、人群和個體之間DNA序列的差異以及這些差異所表現(xiàn)的意義將對疾病的診斷、治療和預(yù)防帶來革命性的變化。今后單核苷酸多態(tài)性的研究將在多個領(lǐng)域發(fā)揮作用，其中包括：①進(jìn)行疾病的遺傳連鎖分析(linkage analysis)及關(guān)聯(lián)分析(association analysis)，用于疾病易感基因的定位；②在藥物基因組學(xué)(pharmacogenomics)研究中，通過檢測SNPs的遺傳多態(tài)性標(biāo)記揭示人群中不同個體對不同藥物的敏感性差異。這些研究將為“個體化醫(yī)療”奠定基礎(chǔ)。

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