S100A4蛋白在卵巢漿液性腺癌中的表達及其臨床意義*

朱安娜，李俊東，馮艷玲，徐漫漫，肖 娟

(1華南腫瘤學國家重點實驗室，2中山大學腫瘤防治中心婦科，廣東 廣州 510060;3汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院婦科，廣東 汕頭 515000)

卵巢漿液性腺癌(ovarian serous adenocarcinoma)是卵巢上皮性癌最常見的亞型，易發生局部侵襲及遠處轉移，5年生存率波動于20% ～65%［1-2］。侵襲和轉移已經成為卵巢漿液性腺癌患者治療困難和預后差的重要原因之一。S100蛋白是由 Moore［3］1965年從牛腦組織中分離出的一種低分子量(10～12 kD)鈣離子結合蛋白，該蛋白家族具有共同的EF雙螺旋結構的氨基酸序列，能與鈣離子結合導致S100蛋白構象發生改變，暴露與靶蛋白的結合位點，隨之與靶蛋白結合，在體內發揮多種生物學功能如細胞增殖分化、肌肉收縮、細胞周期調控、基因表達、細胞凋亡等［4-5］。S100A4蛋白是S100蛋白家族成員之一，由101個氨基酸組成的多肽，分子量為11.5 kD。該蛋白被歸類于一種轉移促進因子，具有促進腫瘤侵襲轉移的能力。本研究通過免疫組化方法檢測S100A4蛋白在卵巢漿液性腺癌中的表達情況，探討S100A4蛋白表達與卵巢漿液性腺癌發生發展的關系及其臨床意義。

材料和方法

1 研究對象

收集1999年11月～2006年3月在中山大學腫瘤防治中心接受手術治療的卵巢漿液性腺癌組織標本共69例。入選的卵巢漿液性腺癌患者術前均未接受化療、放療和其它治療;且均在我院行卵巢癌全面分期手術或腫瘤細胞減滅術，術后病理明確診斷為卵巢漿液性腺癌;患者無合并身體其它器官腫瘤。入選患者均有5年隨訪資料，隨訪時間為8個月～130個月，其中31例死亡，38例生存。按2009年卵巢癌FIGO分期系統進行分期，Ⅰa期4例，Ⅰc期9例，Ⅱa期4例，Ⅱb期7例，Ⅱc期5例，Ⅲa期1例，Ⅲb期4例，Ⅲc期32例，Ⅳ期3例。所有組織標本均經10%甲醛固定，石蠟包埋，常溫下保存。

選擇同期在我院首診的45例卵巢漿液性腺瘤和20例卵巢交界性漿液性腺瘤作為對照組。

卵巢癌復發的判斷標準:CA125進行性升高;體檢發現腫塊;影像學檢查發現腫塊;出現胸腹水;不明原因腸梗阻。出現上述中的2項視為復發。

2 主要試劑

S100A4兔抗人多克隆抗體購自Abcam，工作濃度為1∶200。通用型二步法檢測試劑盒，購自北京中杉-金橋生物技術有限公司，為非生物素兔二步法檢測試劑盒。

3 免疫組化方法及判定標準

采用免疫組化二步法，整個過程按試劑盒說明書進行，用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。免疫組化結果判斷［6］:在光學顯微鏡下觀察組織標本的陽性細胞比率及著色程度。高倍鏡下(放大200倍)隨機取4個不同的視野，計數細胞總數及陽性細胞數，按陽性細胞所占的百分比計分:陽性細胞率≤5%為0分;＞5%且≤25%為1分;＞25%且≤50%為2分;＞50%且≤75%為3分;＞75%為4分。同時，根據染色的強弱程度計分:無著色1分;淡黃色2分;黃色3分;深黃色4分。根據兩者的乘積來判斷結果:0分為(-);1～2分為(+);3～4分為(++);＞5分為(+++)。統計分析時(-)和(+)為低表達，(++)和(+++)為高表達。

4 隨訪

隨訪方式采取門診復查、電話和信件相結合，所有復發、轉移病理均經臨床、影像學或病理學證實。從手術之日起隨訪至死亡之日或隨訪終止日。隨訪終止日為2011年4月。

5 統計學處理

采用SPSS 13.0進行數據分析。計數資料用卡方檢驗或精確概率法檢驗;生存分析采用Kaplan-Meier法及log-rank檢驗比較生存曲線的差異。用Cox比例風險模型進行多因素回歸分析。以P＜0.05(雙側檢驗)為差異有統計學意義。

結 果

1 S100A4蛋白在卵巢漿液性腺癌及各對照組中的表達

S100A4蛋白陽性表達的淺黃色至棕黃色顆粒見于腫瘤細胞的細胞核和細胞質，見圖1。卵巢漿液性腺癌、卵巢交界性漿液性腺瘤和卵巢漿液性腺瘤組織中S100A蛋白的高表達率分別為78%、30%和27%，S100A4蛋白在卵巢漿液性腺癌組織中的高表達率顯著高于兩個對照組(P＜0.05)。而兩個對照組S100A4蛋白高表達率差異無統計學意義(P＞0.05)。

Figure 1.The expression of S100A4 protein in ovarian serous tumors(immunohistochemical staining，×200).A:ovarian serous adenoma;B:ovarian borderline serous adenoma;C:ovarian serous adenocarcinoma.圖1 S100A4蛋白在3種卵巢漿液性腫瘤組織中的表達

2 S100A4蛋白表達與卵巢漿液性腺癌患者臨床病理特征的關系

統計分析顯示，不同病理分級組S100A4蛋白高表達率差異有統計學意義(P＜0.05)，且隨著病理分級升高S100A4蛋白高表達率亦隨之升高。復發組和未復發組S100A4蛋白高表達率差異有統計學意義(P＜0.01)，復發組的S100A4蛋白高表達率高于未復發組。此外，未發現S100A4蛋白表達與卵巢漿液性腺癌患者的年齡、腫瘤直徑、術前血清CA125水平、FIGO分期相關(均P＞0.05)，見表1。

表1 S100A4蛋白高表達率與卵巢漿液性腺癌患者臨床病理特征的關系Table 1.Correlation between the expression of protein S100A4 and clinicopathological characteristics of ovarian serous adenocarcinoma

3 卵巢漿液性腺癌患者的生存分析

單因素分析結果顯示患者無疾病進展時間(progression-free survival，PFS)與病理分級(P ＜0.05)、FIGO分期(P＜0.01)、術后殘留病灶大小(以殘留病灶≤1 cm和殘留病灶＞1 cm為標準分2組)(P＜0.01)及S100A4蛋白表達(P=0.01)有關;總生存時間(overall survival，OS)與術前血清CA125水平(P＜0.05)、病理分級(P＜0.01)、FIGO分期(P＜0.01)、術后殘留病灶大小(P＜0.01)及S100A4蛋白表達(P＞0.05)有關，生存曲線見圖2。多因素Cox比例風險模型的預后分析結果顯示:術后殘留病灶大小(P＜0.01)和病理分級(P＜0.01)是影響卵巢漿液性腺癌預后的獨立因素，而S100A4蛋白表達(P＞0.05)不是影響卵巢漿液性腺癌預后的獨立因素。

討 論

侵襲和轉移是惡性腫瘤的特征，與細胞凋亡、新生血管形成［7］等密切相關。S100A4蛋白是S100蛋白家族成員之一，通過抑制細胞凋亡［8］、促進血管生成［9-10］、增強腫瘤細胞侵襲能力［11］、調節細胞運動性［12］、降解和重塑細胞外基質［13］、降低細胞粘附力［14］等機制促進腫瘤轉移。研究證實S100A4蛋白在人類多種惡性腫瘤如結腸癌［15］、胃癌［16］、腎癌［17］、胰腺癌［18］、膀胱癌［19］、甲狀腺癌［20］、黑色素瘤［21］、子宮內膜癌［22］等表達，且其表達率與腫瘤遠處轉移、預后差有關，可作為一種預后標志物及分子治療靶點，而通過對一些強表達S100A4的惡性腫瘤細胞系和荷瘤小鼠模型的研究證實，敲除S100A4基因可導致腫瘤細胞侵襲轉移能力下降甚至消失［23］。已有文獻報道S100A4蛋白在卵巢漿液性腺癌組織的表達較卵巢良性腫瘤組織明顯增高，但尚未見S100A4蛋白與卵巢漿液性腺癌預后關系的進一步研究。

Figure 2.Kaplan-Meier curves for the patients with ovarian serous carcinoma.A:progression-free survival;B:overall survival.圖2 卵巢漿液性腺癌患者S100A4低表達組和高表達組生存曲線圖

Kwak等［24］報道127例結直腸癌患者S100A4蛋白表達陽性率為35.4%，而在正常結直腸粘膜中S100A4蛋白表達缺乏。類似的結果在其它惡性腫瘤如乳腺癌［25］、膀胱癌［26］等亦觀察到。本研究中卵巢漿液性腺癌組S100A4蛋白高表達率為78%，明顯高于兩個對照組(卵巢漿液性腺瘤組和卵巢交界性漿液性腺瘤組)，而兩個對照組S100A4蛋白高表達率差異無統計學意義。提示S100A4蛋白表達上調在卵巢漿液性腺癌的發生發展中可能起一定作用。

趙峻波等［27］發現S100A4蛋白在宮頸鱗癌中的表達與臨床分期和淋巴結轉移有關。Kwon等［28］對前列腺癌的研究發現S100A4蛋白高水平表達與前列腺癌組織的腫瘤分級有關。Kwak等［24］則發現S100A4蛋白陽性表達與結直腸癌的腫瘤復發相關。本研究中通過對S100A4蛋白高表達率與卵巢漿液性腺癌臨床病理特征關系的統計分析，發現S100A4蛋白高表達率與卵巢漿液性腺癌的病理分級有關，且隨著病理分級增高，S100A4蛋白高表達率亦隨之增高。一般而言，病理分級越高，癌細胞侵襲力越強，惡性度越高，更易發生腫瘤轉移。從而推測病理分級高的卵巢漿液性腺癌細胞可能部分通過S100A4蛋白表達上調途徑增強其侵襲轉移能力，或者兩者在癌細胞侵襲轉移過程可能發揮協同效應，需進一步研究證實。此外，研究也發現復發組的S100A4蛋白高表達率高于未復發組，可能與S100A4蛋白高表達的腫瘤更具侵襲力、更易發生轉移有關，提示卵巢漿液性腺癌患者接受治療后，S100A4蛋白高表達的患者較S100A4蛋白低表達的患者，有更高的復發風險，因而檢測S100A4蛋白的表達可以成為預測卵巢漿液性腺癌患者治療后復發風險的因子之一。本研究中，未發現S100A4蛋白表達與患者術前CA125水平以及腫瘤直徑有關，推測術前CA125水平高低及腫瘤直徑大小與腫瘤的侵襲力可能不存在相關關系。

Kwak等［24］研究發現 S100A4蛋白表達陽性與結直腸癌復發、更差的總生存期相關。Mastumoto等［26］亦發現S100A4蛋白是膀胱癌治療結局的一個獨立預后因子。本研究對69例卵巢漿液性腺癌病例進行生存分析，單因素分析發現患者無疾病進展時間(PFS)與總生存時間(OS)均與S100A4蛋白表達有關?？梢园l現S100A4蛋白高表達是卵巢漿液性腺癌患者預后差的相關因素，可作為預測卵巢漿液性腺癌患者預后的因子。

多因素分析顯示手術后殘留病灶大小和病理分級是影響卵巢漿液性腺癌預后的獨立因素，提示病理分級相對于其它臨床病理因素對于卵巢漿液性腺癌患者的預后具有更大的影響。手術的徹底性對于患者的預后意義亦較大，故提倡手術治療卵巢漿液性腺癌患者時應盡最大可能的切除病灶，盡量達到滿意減瘤。結果還顯示S100A4蛋白表達不是影響卵巢漿液性腺癌預后的獨立因素，是否與本組病例數不夠有關，尚待進一步研究證實。

［1］Raspollini MR，Amunni G，Villanucci A，et al.Prognostic significance of microvessel density and vascular endothelial growth factor expression in advanced ovarian serous carcinoma［J］.Int J Gynecol Cancer，2004，14(5):815-823.

［2］朱 瑾，孫 紅.復旦大學附屬婦產科醫院卵巢漿液性腺癌10年回顧分析［J］.現代婦產科進展，2011，20(1):48-49.

［3］Moore BW.A soluble protein characteristic of the nervous system ［J］.Biochem Biophys Res Commun，1965，19(6):739-744.

［4］Mazzuccheli L.Protein S100A4:too long overlooked by pathologists?［J］.Am J Pathol，2002，160(1):7-13.

［5］Donate R.S100:a multigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-hand type with intracellular and extracellular functional roles［J］.Int J Biochem Cell Biol，2001，33(7):637-668.

［6］許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準［J］.中國癌癥雜志，1996，6(4):229-231.

［7］堯良清，顧漪萍，豐有吉，等.卵巢癌血管生成的多樣性［J］.中國病理生理雜志，2008，24(1):195-197.

［8］Grigorian M，Lukanidin E.Activator of metastasis in cancer cells，Mst1/S100A4 protein binds to tumor suppressor protein p53 ［J］.Genetika，2003，39(7):900-908.

［9］Ambartsumian N，Klingelhofer J，Grigorian M，et al.The metastasis-associated Mts1(S100A4)protein could act as an angiogenic factor［J］.Oncogene，2001，20(34):4685-4695.

［10］Semov A，Moreno MJ，Onichtchenko A，et al.Metastasis-associated protein S100A4 induces angiogenesis through interaction with Annexin II and accelerated plasmin formation［J］.J Biol Chem，2005，280(21):20833-20841.

［11］Matsuura I，Lai CY，Chiang KN.Functional interaction between Smad3 and S100A4(metastatin-1)for TGF-beta-mediated cancer cell invasiveness［J］.Biochem J，2010，426(3):327-335.

［12］Li ZH，Bresnick AR.The S100A4 metastasis factor regulates cellular motility via a direct interaction with myosin-IIA ［J］.Cancer Res，2006，66(10):5173-5180.

［13］Schmidt-Hansen B，Orn?s D，Grigorian M，et al.Extracellular S100A4(mts1)stimulates invasive growth of mouse endothelial cells and modulates MMP-13 matrix metalloproteinase activity［J］.Oncogene，2004，23(32):5487-5495.

［14］Moriyama-Kita M，Endo Y，Yonemura Y，et al.S100A4 regulates E-cadherin expression in oral squamous cell carcinoma ［J］.Cancer Lett，2005，230(2):211-218.

［15］Hemandas AK，Salto-Tellez M，Maricar SH，et al.Metastasis-associated protein S100A4-a potential prognostic marker for colorectal cancer［J］.J Surg Oncol，2006，93(6):498-503.

［16］Kim YJ，Kim MA，Im SA，et al.Metastasis-associated protein S100A4 and p53 predict relapse in curatively resected stage III and IV(M0)gastric［J］.Cancer Invest，2008，26(2):152-158.

［17］Bandiera A，Melloni G，Freschi M，et al.Prognostic factors and analysis of S100A4 protein in resected pulmonary metastases from renal cell carcinoma ［J］.World J Surg，2009，33(7):1414-1420.

［18］Ikenaga N，Ohuchida K，Mizumoto K，et al.S100A4 mRNA is a diagnostic and prognostic marker in pancreatic carcinoma［J］.J Gastrointest Surg，2009，13(10):1852-1858.

［19］Matsumoto K，Irie A，Satoh T，et al.Expression of S100A2 and S100A4 predicts for disease progression and patient survival in bladder cancer［J］.Urology，2007，70(3):602-607.

［20］Min HS，Choe G，Kim SW，et al.S100A4 expression is associated with lymph node metastasis in papillary microcarcinoma of the thyroid ［J］.Mod Pathol，2008，21(6):748-755.

［21］Andersen K，Nesland JM，Holm R，et al.Expression of S100A4 combined with reduced E-cadherin expression predicts patient outcome in malignant melanoma［J］.Mod Pathol，2004，17(8):990-997.

［22］Xie R，Loose DS，Shipley GL，et al.Hypomethylationinduced expression of S100A4 in endometrial carcinoma［J］.Mod Pathol，2007，20(10):1045-1054.

［23］Shi Y，Zou M，Collison K，et al.Ribonucleic acid interference targeting S100A4(Mts1)suppresses tumor growth and metastasis of anaplastic thyroid carcinoma in a mouse model［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91(6):2373-2379.

［24］Kwak JM，Lee HJ，Kim SH，et al.Expression of protein S100A4 is a predictor of recurrence in colorectal cancer［J］.World J Gastroenterol，2010，16(31):3897-3904.

［25］Ismail NI，Kaur G，Hashim H，et al.S100A4 overexpression proves to be independent marker for breast cancer progression ［J］.Cancer Cell Int，2008，8:12.

［26］Matsumoto K，Irie A，Satoh T，et al.Expression of S100A2 and S100A4 predicts for disease progression and patient survival in bladder cancer［J］.Urology，2007，70(3):602-607.

［27］趙峻波，喬玉環，史惠容，等.S100A4蛋白在宮頸鱗癌中的表達及意義［J］.河南腫瘤學雜志，2005，18(1):4-5.

［28］Kwon YW，Chang IH，Kim KD，et al.Significance of S100A2 and S100A4 expression in the progression of prostate adenocarcinoma［J］.Korean J Urol，2010，51(7):456-462.