LPS誘導胰腺癌細胞Panc－1表達B7－H1*

馬 君，黃東勝，金洪傳，劉軍偉，沈國梁，汪 帆

(浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院1普外科，2浙江省生物治療重點實驗室，3生物醫學研究中心，浙江 杭州 310016)

胰腺癌是一種極度惡性的消化道腫瘤，具有高度的侵襲性，對放化療均不敏感，發病率接近于死亡率。目前，根治性手術切除是治療胰腺癌最有效的手段，但由于早期癥狀隱匿不易診斷而易喪失手術機會，且腫瘤在早期就易侵犯周圍組織并向遠處轉移，因此預后很差，術后5年生存率僅為8% ～10%［1］。因此，積極探索胰腺癌的治療方法具有重要的臨床意義。近年來腫瘤細胞表面表達的B7－H1分子和 Toll樣受體(Toll－like receptors，TLRs)與腫瘤免疫逃逸的關系倍受關注。B7－H1是Dong等［2］從人類基因庫搜索B7同源分子時在胎盤cDNA文庫中確認的，它編碼一個290個氨基酸的I型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，表達于靜息的T細胞、B細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞上，同時也表達于絕大多數的腫瘤組織中。B7－H1可通過誘導T細胞的凋亡抑制機體對腫瘤的免疫反應，從而參與腫瘤的免疫逃逸過程［3－4］。TLRs是新發現的先天性免疫的病原識別受體，其中TLR4是第一個被發現的哺乳動物TLR，主要配體為革蘭陰性桿菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，TLR4的活化可激活一系列的信號轉導通路，如絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)家族，很多研究表明TLR4被活化后可使腫瘤細胞逃避人體的免疫監視［5］。在本實驗中我們發現LPS刺激可以上調胰腺癌細胞株Panc－1中B7－H1的表達，進一步的實驗證實p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinase，p38)和細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal－regulated kinases，ERK)的活化在LPS誘導B7－H1的表達中發揮重要作用。因此，本實驗通過探討B7－H1表達的分子機制，為胰腺癌的治療提供理論基礎。

材料和方法

1 材料

人胰腺癌細胞株Panc－1購自中國科學院細胞庫;DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco;LPS(E.coli O111∶B4)、SB203580(p38 的抑制劑)、PD98059(ERK的抑制劑)和SP600125［c－Jun氨基端激酶(c－Jun N－terminal kinase，JNK)的抑制劑］均購于Sigma;p－ERK、ERK、p－JNK、JNK、p－p38的單克隆抗體和p38的多克隆抗體均購自Cell Signaling;PE標記的抗人TLR4單克隆抗體以及它的同型對照抗體購自eBioscience;鼠抗人B7－H1單克隆抗體購自R＆D;Trizol試劑購自Invitrogen;M－MLV逆轉錄酶購于Promega;SYBR Green I購自TaKaRa;RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天公司;B7－H1和GAPDH引物序列由上海Invitrogen合成。

2 方法

2.1 細胞培養 人胰腺癌細胞株 Panc－1用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養基，在 37℃、5%CO2的培養箱中常規培養。用0.25%胰酶(含EDTA)消化傳代。細胞在培養12h后再加入LPS或是各種抑制劑。

2.2 流式細胞術檢測TLR4在人胰腺癌細胞株Panc－1上的表達 將Panc－1細胞以4.0×105/well的密度接種于6孔板中，培養48 h后消化收集細胞。1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)重懸，調節細胞濃度為1×1010/L，加入5 μL PE標記的CD284抗體(鼠IgG2a抗體作為同型對照)，4℃避光孵化30 min。加入2 mL 1×PBS，400 r/min 4℃離心5 min，洗2遍。500 μL 1×PBS重懸細胞后用FACS Calibur流式細胞儀檢測，結果用BD CellQuest軟件分析。

2.3 實時定量PCR檢測Panc－1細胞B7－H1 mRNA的表達 將Panc－1細胞以4.0×105/well的密度接種于6孔板中，共鋪3組，培養12 h后分別做如下處理:第1組加入LPS使其終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0 mg/L后繼續培養4 h;第2組加入終濃度為1.0 mg/L的LPS后分別繼續培養0、2、4和8 h;第3組1孔不做任何處理，另1孔加入1.0 mg/L LPS，其余孔分別用20μmol/L SB203580、20 μmol/L PD98059和10 μmol/L SP600125預處理2 h，加入1 mg/L LPS繼續培養4 h。消化收集細胞，Trizol法提取總RNA，并用NanoDrop2000C分光光度計測定濃度。取0.5μg總RNA，按照Promega逆轉錄試劑盒提供的操作步驟制備cDNA。根據TaKaRa熒光定量PCR試劑盒提供的操作步驟，以GAPDH作為內參照，進行real－time PCR反應，所用的引物序列如下:B7－H1上游引物序列5'－GGTGCCGACTACAAGCGAAT－3'，下游引物序列 5'－GGTGACTGGATCCACAACCAA－3';GAPDH上游引物序列5'－ACGGATTTGGTCGTATTGGG－3'，下游引物序列5'－CCTGGAAGATGGTGATGGGATT－3'。結果用 ABI Prism 7500 real－time PCR System進行分析。每組實驗均重復4遍。

2.4 Western blotting檢測 Panc－1細胞中 p－p38、p－ERK、p－JNK和 B7－H1的表達 Panc－1細胞以4.0×105/well的密度接種于6孔板中，共接種5組，培養12 h后各組做如下處理:第1組加入LPS使其終濃度分別為 0、0.5、1.0、2.0 mg/L 培養 24 h;第2組以1.0 mg/L LPS分別培養0、12、24和36 h;第3組加入 1.0 mg/L LPS，分別培養 0、15、30、60 和90 min;第4、5組1孔不做任何處理，另1孔加入1.0 mg/L LPS，其余孔分別用 20 μmol/L SB203580、20 μmol/L PD203580和10 μmol/L SP600125預處理2 h，其中第4組加入1.0 mg/L LPS分別繼續培養15、30、60 min，而第5組加入1.0 mg/L LPS培養24 h。消化收集細胞，RIPA裂解液提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，10%的分離膠分離蛋白后將蛋白轉移到硝酸纖維膜上，用特異性的抗體去檢測第1、2、5組中B7－H1的表達以及第3、4組中 p－p38、p－ERK和p－JNK的變化，以 GAPDH和總的p38，ERK、JNK作為標準參照。結果用LAS－4000－Mini化學發光成像系統進行分析。

3 統計學處理

結 果

1 LPS誘導Pcnc－1細胞中B7－H1的表達上調

通過LPS刺激Panc－1細胞發現，LPS可以誘導胰腺癌細胞株Panc－1中B7－H1的表達。如圖1所示，B7－H1 mRNA表達水平在LPS刺激后明顯上調，且呈現一定的濃度依賴性，隨著LPS濃度的增加，B7－H1的表達水平也逐漸升高，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，且當LPS濃度為1.0 mg/L時，其表達出現最高峰，見圖1A。為了驗證 B7－H1 mRNA表達的時間依賴性，我們用1.0 mg/L LPS處理Panc－1細胞不同的時間，結果發現B7－H1 mRNA也呈現明顯的時間梯度，隨著時間的延長，B7－H1 mRNA的表達水平也逐漸升高，且在4h的時侯其表達水平最高，見圖1B。與此同時我們用Western blotting也證實了B7－H1在蛋白水平上的表達也具有相應的濃度和時間依賴性，其在LPS濃度為1.0 mg/L，刺激時間為24 h的時侯表達水平最高，見圖1C、D。以上結果表明在胰腺癌細胞中LPS能顯著上調B7－H1的表達，并具有一定的濃度和時間依賴性。

Figure 1.LPS induced up－regulation of the expression of B7－H1 in Panc－1 cells.Dose－dependent(A and C)and time－dependent(B and D)mRNA(A and B)and protein(C and D)expression of B7－H1 was observed in Panc－1 cells following LPS stimulation..n=4.*P＜0.05 vs 0 mg/L or 0 h.圖1 LPS誘導Panc－1細胞中B7－H1的表達上調

2 LPS刺激后可以活化Panc－1細胞中MAPKs信號通路

結果顯示，TLR4表達于Panc－1細胞上，見圖2A。LPS刺激后，p－p38、p－ERK和 p－JNK的表達水平隨著作用時間的延長而增加，并分別在15、30、60 min時達到最高峰，見圖2B－D，這表明在胰腺癌細胞中LPS可以活化MAPKs信號通路。

Figure 2.LPS activated MAPKs pathway.A:TLR4 expression on Panc－1 cells，the grey line indicates staining with unrelated isotype－matched control antibody.LPS induced the phosphorlation of p38(B)，ERK(C)and JNK(D)..n=4.*P＜0.05 vs 0 min.圖2 LPS活化MAPKs通路

3 MAPKs信號通路在LPS誘導Panc－1細胞表達B7－H1的過程中起著重要作用

3種抑制劑的抑制效果如圖3所示:當SB203580、PD98059和 SP600125的濃度分別為20 μmol/L、20 μmol/L 和 10 μmol/L 時可以顯著下調p38、ERK和JNK的磷酸化水平。抑制p38或ERK都能顯著下調由LPS誘導的B7－H1的表達(P＜0.05);抑制JNK的活化在LPS誘導的B7－H1表達中沒有明顯作用(P＞0.05)，見圖4。

討 論

胰腺的原發性腫瘤主要來源于3種組織:胰腺外分泌、內分泌和間葉組織，而在所有的胰腺癌中，導管腺癌占胰腺癌的80% ～90%，因此我們選用來源于導管細胞的人胰腺癌細胞株Panc－1來研究LPS通過活化TLR4－MAPKs信號通路誘導B7－H1表達的分子機制。我們發現LPS刺激Panc－1細胞后可上調B7－H1的表達，且呈一定的濃度和時間相關性。同時我們用p38、ERK及JNK的特異性抑制劑來研究它們磷酸化水平的變化與B7－H1表達水平的關系，我們發現LPS誘導的B7－H1表達可受p38和ERK磷酸化水平變化的調節，而與JNK磷酸化水平的變化沒有明顯的相關性。

LPS與 TLR4結合后活化 MAPKs信號通路，MAPKs是細胞內的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，它受到刺激后磷酸化而活化，近年來許多研究發現MAPKs信號轉導途徑在腫瘤的分化、侵襲和轉移中都起著重要作用，它包括多個亞族，其中p38、ERK和JNK是最主要的3條信號途徑［6］。我們的研究表明LPS刺激胰腺癌細胞株Panc－1后，p38、ERK和JNK磷酸化水平呈時間依賴性顯著上調。之前已有報道證實干擾素調節因子1(interferon regulatory factor－1，IRF －1)和兩面神激酶(Janus kinase，JAK)/信號轉導及轉錄因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)通路在干擾素 －γ(interferon－γ，INF－γ)誘導B7－H1的表達過程中起著重要作用［7］。但關于LPS誘導B7－H1表達的機制尚沒有相關的研究報道。我們的研究發現，LPS刺激能使p38、ERK和JNK的磷酸化水平都顯著升高，但只有p38和ERK的活化與B7－H1的表達具有明顯相關性，而JNK的磷酸化水平變化與B7－H1的表達關系不大。進一步研究JNK活化參與的調控機制將很有意義。我們的實驗第一次證實了在人胰腺癌細胞株Panc－1上，LPS可能通過活化p38和ERK來調控B7－H1的表達。

Figure 3.Inhibition of LPS－induced phosphorylation with specific inhibitors of MAPKs.A:p38 inhibitor;B:ERK inhibitor;C:JNK inhibitor..n=4.*P＜0.05 vs LPS.圖3 特異性抑制劑對LPS誘導活化MAPKs通路的影響

Figure 4.p38 and ERK were involved in LPS－induced B7－H1 expression.A－C:mRNA expression;D－F:protein expression.A，D:p38 inhibitor;B，E:ERK inhibitor;C，F:JNK inhibitor..n=4.*P＜0.05 vs LPS.圖4 p38和ERK對LPS誘導B7－H1 mRNA和蛋白的表達的影響

已有研究發現B7－H1通過誘導T細胞凋亡抑制腫瘤免疫反應促進腫瘤生長。B7－H1阻斷可增強單核細胞來源的未成熟樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)的免疫刺激活性，增強淋巴細胞增殖的能力［8］。在胰腺癌小鼠模型中用特異性抗體阻斷B7－H1的表達能顯著抑制腫瘤的進展，同時上調INF－γ及下調白細胞介素－10(interleukin－10，IL－10)的表達，且與治療胰腺癌的化療藥物吉西他濱聯合使用有協同作用［9］。Gong等［10］證實在膽管上皮中miRNA－513參與了B7－H1的翻譯調控。而我們的實驗首次在人胰腺癌Panc－1細胞株中證實，p38和ERK可調控B7－H1的表達。至于在人胰腺癌Panc－1細胞株中是否也存在miRNA對B7－H1表達調控目前尚不清楚，LPS的作用能否調控相關miRNA的水平也很值得進一步探索。

近年來研究發現，小鼠結腸癌細胞株(MC26)、乳腺癌細胞株(4T1)、前列腺癌細胞株(RM1)、黑色素瘤細胞株(B16)以及肺癌細胞株(LLC1)表面均表達TLR4。盡管對于在腫瘤上存在何種TLR4配體我們還不是很了解，但近來的研究顯示包括LPS在內的如紫杉醇、熱休克蛋白60(heat－shock protein 60，HSP60)、HSP70、呼吸道合胞病毒的融合蛋白以及鼠乳腺腫瘤病毒的包膜蛋白均能活化 TLR4［11］。用LPS刺激MC26，發現細胞培養上清液能夠顯著抑制T細胞的增殖及NK細胞的活化，從而使腫瘤逃避免疫監視，導致腫瘤生長加速。另外，Kelly等［12］發現TLR4表達于人卵巢癌上皮細胞表面，被LPS激活后可誘導細胞增殖和增強細胞因子的產生，他們提出腫瘤細胞可通過TLRs調控腫瘤微環境并影響免疫細胞的活性。B7－H1正是在腫瘤的免疫逃逸過程中發揮著重要作用的分子，另有研究表明在小膠質細胞以及U937細胞(人巨噬細胞系)中，LPS刺激均能使B7－H1的表達上調。這些研究使我們把TLR4的活化和B7－H1的表達聯系起來，通過TLR4這一中介進一步去研究胰腺癌細胞中B7－H1表達的調控機制。而我們的研究也恰好證實了我們的猜想。另外，TLR4的活化還可以激活磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)進行信號轉導［13］，而對于PI3K信號的激活與B7－H1的表達之間是否存在某種關聯尚需要進一步研究。

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