二甲雙胍對高脂飲食誘導的胰島素抵抗大鼠LPIN1表達及AMPK通路的作用*

莊向華，劉元濤，倪一虹，孫福敦，陳詩鴻

(山東大學第二醫院內分泌科，山東 濟南 250033)

脂肪組織作為一種內分泌器官，可分泌多種脂肪因子如瘦素、抵抗素、脂聯素、內脂素等，在糖脂代謝調節過程中發揮重要的作用［1］。LPIN1蛋白是一種新發現的基因LPIN1表達蛋白，在fld小鼠中基因缺失，其作用缺陷可以導致脂肪細胞分化障礙、糖代謝受損、高脂血癥［2］。動物研究表明LPIN1基因表達與肥胖、胰島素抵抗負相關。LPIN1的生理學作用目前尚未完全明確。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一種重要的蛋白激酶，能調節能量代謝，被稱為“能量感受器”。除調節機體能量代謝外，AMPK也參與機體胰島素敏感性的調節。研究發現，AMPK基因剔除可誘導小鼠胰島素抵抗;而AMPK過表達或AMPK特異性激活劑均具有胰島素增敏效應［3］。二甲雙胍可以激活AMPK信號通路，抑制肝臟的糖異生，促進脂肪酸氧化，改善胰島素敏感性。本課題從肝臟胰島素抵抗發病機制出發，通過高脂喂養誘導大鼠產生胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，觀察大鼠肝臟LPIN1和AMPKα表達、活性的變化。造模成功后應用二甲雙胍進行干預，探討LPIN1在胰島素抵抗發生過程中可能的作用機制。

材料和方法

1 動物

雄性Wistar大鼠36只，購于山東大學醫學院實驗動物中心，體重160～200 g，動物的飼養遵照山東大學醫學院倫理委員會規定。給予標準飼料，自由取食和飲水。適應性飼養1周后，按體重隨機分為2組:對照組(control，Con組)12只，給予大鼠食用的標準飼料，含有5%的脂肪、53%碳水化合物、23%蛋白質，熱量含量為25 kJ/kg;高脂飼養組(high-fat diet，HF組)24只，給予高脂飲食，含有22%脂肪、48%碳水化合物以及20% 蛋白質，熱量含量為44.3 kJ/kg［4］。高脂飲食飼料購自北京科奧協力飼料有限公司。每周監測大鼠體重和血糖。實驗組喂養8周后將高脂組大鼠隨機分為高脂(HF)組12只和二甲雙胍干預(metformin intervention，MET)組12只，2組除繼續喂以高脂飼料外，MET組用二甲雙胍灌胃，劑量為200 mg·kg-1·d-1，每周稱重1次，據此調整劑量;Con組應用標準飼料繼續喂養8周。第16周末再次行鉗夾實驗評價各組IR情況。大鼠過夜空腹12 h，鉗夾實驗前頸動脈取血測定血糖，并分離血清于-70℃保存用于生化指標檢測;鉗夾實驗結束后處死動物，留取肝臟標本-70℃保存備用。

2 高胰島素－正葡萄糖鉗夾實驗［5］

實驗前4～5 d在麻醉下行頸動脈和頸靜脈埋植式插管術，在動物清醒、自由活動狀態下行鉗夾實驗。將諾和靈R以13mU·kg-1·min-1的速度持續泵入，每10 min監測1次血糖，保持血糖在4.5～5.5 mmol/L范圍內，達到穩態，進行120 min，計算葡萄糖輸注率(glucose infusion rate，GIR)。

3 生化指標檢測

大鼠尾靜脈取血，離心后分離血清，將血清樣品放入低溫冰箱中保存，供測定時使用。血糖測定采用葡萄糖氧化酶法，使用美國強生公司(Life Scan)強生穩豪型OneTouch UltraEasy血糖儀。血清胰島素采用放射免疫法測定(Linco Research)。血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)水平應用Beckman DXC 800型生化自動分析儀測定。

4 肝臟TG和TC含量分析

［6］方法進行，組織經氯仿/甲醇抽提后用全自動生化分析儀測定。稱取100 mg組織標本放入1 mL氯仿/甲醇(體積比為2∶1)中，用電動勻漿器勻漿。勻漿移入干凈試管中，在室溫下搖動過夜，然后加入1 mL 0.6%氯化鈉混勻，2000 r/min離心15 min使水與有機界面分開，底層的氯仿層小心移入玻璃管，用氮氣吹干后再溶于適量乙醇中，用全自動生化分析儀(Beckman)測定。

5 實時定量real－time PCR方法檢測基因表達

應用實時定量 PCR檢測 LPIN1、AMPKα1、AMPKα2和β-actin mRNA的表達。采用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA，取100 mg左右的肝臟組織，按照說明書操作，RNA于紫外分光光度計定量后于-80℃儲存備用。采用反轉錄反應試劑盒合成cDNA，按照說明書操作。PCR反應條件:95℃3 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個循環;72℃ 10 min。于每個循環延伸反應最后時刻收集熒光信號。熔解曲線設置:95℃ 1 s，60℃ 2 min，以0.2℃/s的升溫速度升溫至95℃，升溫時連續收集熒光信號。應用實時熒光定量PCR儀(ABI Prism 7500 Detection System)檢測。PCR引物由上海生物工程公司合成，引物設計如下:AMPKα1正義鏈5'-CATTCTTGGTTGCCGAAACA-3'， 反義鏈5'-TGTTTGGATTTCTGTGGGTT-3';AMPKα2正義鏈5'-TGTAAACACGGGAGGGTTGAA-3'，反義鏈5'-GGCAGACAGAATCTGCTGGAA-3';LPIN1正義鏈5'-CGCCAAAGAATAACCTGGAA-3'，反義鏈 5'-TGAAGACTCGCTGTGAATGG-3';β-actin正義鏈5'-TGGTGGACCTCATGGCCTAC-3'，反義鏈5'-CAGCAACTGAGGGCCTCTCT-3'。

6 Western blotting方法檢測蛋白水平表達

在冰凍緩沖液中研碎肝臟組織，提取蛋白，在4℃ 20000 r/min離心20 min，小心吸取上清，用BCA法，用標準蛋白擬合曲線，計算蛋白濃度，確定上樣量。取50 μg蛋白在95℃溫度下變性5 min，SDS-PAGE電泳并轉移到PVDF膜。封閉1 h，應用p-AMPKα (Thr172)(Santa Cruz)、AMPKα1、AMPKα2(Abcam)和 LPIN1(Santa Cruz)抗體孵育，加5 μLⅡ抗(1∶2000稀釋)與10 mL封閉緩沖液中充分混勻，加入硝纖膜。取出硝纖膜放入發光液，反復澆硝纖膜約5 min，取出硝纖膜，吸干過多液體，保鮮膜包裹硝纖膜，置于曝光盒中曝光、顯影、定影。GAPDH為內參照，用多功能數字圖像分析儀Kodak Digital Science ID軟件進行分析。

7 統計學處理

結 果

1 一般情況和體重變化

實驗組大鼠給予高脂飲食后，HF組大鼠與Con組相比，體重、空腹血糖、空腹胰島素顯著增高。血漿中和肝臟內TG、TC水平明顯升高(P＜0.01)。HF組動物 GIR值［(18.80±1.57)mg·kg-1·min-1］較 Con 組 ［(24.31 ±2.65)mg·kg-1·min-1］顯著降低(P＜0.01)，提示存在胰島素抵抗。應用二甲雙胍進行干預后，MET組體重、空腹胰島素、空腹血糖、TG和TC水平均較HF組下降，有顯著差異。MET組GIR值［(21.35±1.26)mg·kg-1·min-1］較HF組顯著提高(P＜0.05)，提示胰島素抵抗較HF組改善，見表1。

表1 3組大鼠體重、血清學指標以及肝臟脂肪含量的變化Table 1.Changes of body weight，serum indexes and hepatic lipid profiles in the three groups(.n=12)

表1 3組大鼠體重、血清學指標以及肝臟脂肪含量的變化Table 1.Changes of body weight，serum indexes and hepatic lipid profiles in the three groups(.n=12)

*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs Con group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs HF group.Con:control;BW:body weight;FBS:fasting blood sugar;FINS:fasting insulin;TG:triglyceride;TC:total cholesterol;GIR:glucose infusion rate;HF:high fat;MET:metformin.

Group BW(g)FBS(mmol/L)FINS(mU/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)GIR(mg·kg-1·min-1)TG in liver(mmol/g)TC in liver(mmol/g)Con 360±15 5.10±0.44 19.35±6.38 0.83±0.39 1.14±0.24 24.31±2.65 0.48±0.28 0.26±0.08 HF 438±24＊＊ 7.07±1.61* 23.70±7.37* 3.21±1.44＊＊ 3.04±1.62＊＊ 18.80±1.57＊＊ 0.89±0.31＊＊ 0.46±0.20＊＊MET 380±18# 6.32±0.95# 18.19±4.27# 1.36±0.24## 1.85±1.39# 21.35±1.26# 0.57±0.29# 0.31±0.18#

2 LPIN1(mRNA和蛋白)表達

與對照組相比，HF組大鼠肝臟組織中LPIN1 mRNA表達水平顯著降低(P＜0.01)，LPIN1蛋白表達水平減少(P＜0.01)。應用二甲雙胍干預后，大鼠LPIN1 mRNA表達水平較HF組增加(P＜0.01);LPIN1蛋白表達水平增加(P＜0.01)，見圖1、2。

Figure 1.The mRNA expression of LPIN1，AMPKα1 ，and AMPKα2.＊＊P ＜ 0.01 vs Con group;▲▲P ＜0.01 vs HF group.圖1 LPIN1、AMPKα1和AMPKα2 mRNA表達

Figure 2.LPIN1 expression in rat livers in the three groups.＊＊P＜ 0.01 vs Con group;▲▲P＜0.01 vs HF group.圖2 3組大鼠中肝臟LPIN1蛋白表達

3 AMPKα(mRNA和蛋白)和 p－AMPKα活性變化

3組大鼠肝臟組織AMPKα1和AMPKα2 mRNA和蛋白表達均無顯著差異。與Con組大鼠相比，HF組大鼠p-AMPKα(Thr-172)蛋白表達顯著降低(P＜0.01);與HF組相比，應用二甲雙胍干預后p-AMPKα(Thr-172)的表達明顯增加(P＜0.01)，見圖 1、3。

Figure 3.AMPKα1，AMPKα2 and p-AMPKα expression in rat livers in the three groups.＊＊ P ＜ 0.01 vs Con group;▲▲P ＜0.01 vs HF group.圖3 3組動物肝臟中 AMPKα1、AMPKα2和 p－AMPKα蛋白表達

討 論

Lipin是雙向調控身體脂肪代謝的一個家族，由脂素基因(LPIN)所表達產生，包括LPIN1、LPIN2和LPIN3。LPIN1在脂肪組織、肝臟、骨骼肌、心臟等多種組織表達［7］，在脂質合成和基因表達方面有雙重作用，一是作為磷脂酸磷酸酶 (PAP)1發揮促進甘油三酯、磷脂合成作用;二是作為轉錄協同刺激因子聯系肝過氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)γ協同刺激因子1α(PGC1α)和PPARα，調節脂肪酸利用和脂肪合成基因表達［7-8］。研究證明LPIN1和胰島素抵抗密切相關，aP2轉基因鼠中LPIN1的表達和胰島素敏感性有關，其肝臟和脂肪組織中LPIN1表達水平與血漿胰島素濃度負相關，而給予HepG2細胞中高胰島素環境后LPIN1表達下調［8］。芬蘭的研究發現人類脂肪組織中LPIN1 mRNA表達水平與血糖、胰島素、胰島素抵抗等負相關［9］。健康男性中的LPIN1 mRNA與運動過程中呼吸商、氧消耗等相關，與脂肪酸代謝相關蛋白包括PPAR等表達正相關［10］。Harris等［11］研究發現在胰島素信號通路中LPIN1是下游靶基因，在胰島素的刺激作用下，LPIN1蛋白絲氨酸、蘇氨酸位點磷酸化。

肝臟是能量代謝的重要器官，也是胰島素作用的主要靶器官，維持空腹狀態下內生性糖的產生和輸出、進食后糖的吸收、利用和存儲。本研究采用高脂飲食造模，顯示與對照組相比，高脂組大鼠體重、空腹血糖、胰島素、血漿和肝臟中TG、TC水平顯著升高。應用高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗評價胰島素抵抗，結果提示高脂飲食組大鼠的GIR顯著降低(P＜0.01)，LPIN1表達明顯下調;應用二甲雙胍干預后GIR值明顯增加，胰島素抵抗改善，而LPIN1表達水平也顯著增加，提示LPIN1與胰島素抵抗可能存在相關性。

具有胰島素增敏作用的口服降糖藥物二甲雙胍，近年來被證實為AMPK激活劑。它可通過激活AMPK抑制肝糖異生，脂質合成，促進肌肉對葡萄糖的攝取和利用。在肝細胞中二甲雙胍首先激活AMPK，AMPK中α亞單位(包括α1和α2)是催化亞單位，α亞基上172位蘇氨酸磷酸化后，可使乙酰輔酶A羧化酶失活，減少胞漿內丙二酰輔酶A的含量，促進細胞內脂肪酸氧化，調節細胞內糖脂代謝，Liu等［12］發現長期高脂環境可以顯著降低大鼠骨骼肌AMPKα表達和活性，證實AMPKα參與高脂環境誘導胰島素抵抗發生的機制。而本研究顯示高脂組大鼠肝臟中AMPKα表達無明顯改變，p-AMPKα(Thr-172)磷酸化水平顯著降低，二甲雙胍干預后p-AMPKα(Thr-172)表達水平較高脂組顯著增加，提示在胰島素抵抗發生以及二甲雙胍干預過程中主要是AMPKα活性的改變，與文獻資料［1］相符。許多脂肪因子，如瘦素、脂聯素，可通過AMPK在骨骼肌和肝臟中發揮作用。瘦素在外周組織通過AMPK活化而增加葡萄糖的攝取［13］。脂聯素改善代謝的過程與肝臟中AMPK激活進而減少脂肪酸合成，增加線粒體脂肪酸氧化等有關［14］。LPIN1作為一種新的脂肪因子，與胰島素抵抗相關，除了已知的上述兩方面作用機制以外，是否與AMPK通路有關?目前此方面研究較少。Higashida等［15］應用 AMPK激活劑AICAR處理大鼠股三頭肌6 h后，LPIN1 mRNA表達水平顯著增加。我們的研究結果顯示高脂動物模型中，應用AMPK的另一種激活劑二甲雙胍干預后AMPKα活性明顯改善，肝臟LPIN1基因以及蛋白表達均較 HF組明顯增加，進一步提示大鼠肝臟中LPIN1在AMPK信號通路中可能存在作用，AMPK信號通路的激活可以增加LPIN1表達水平，進而調節糖脂代謝，在胰島素抵抗發生發展過程中起到調控作用。

總之，本研究證明在飲食導致的肥胖大鼠肝臟中LPIN1蛋白表達、p-AMPKα(Thr-172)磷酸化水平減少，二甲雙胍干預后二者表達水平增加。然而，該研究也存在一些不足之處。首先，LPIN1 mRNA通過選擇性剪接產生2個蛋白質異構體LPIN1α和LPIN1β，它們在不同位點共同調節糖脂代謝［2］。本研究中的引物和抗體不能區別2種異構體。另外，本研究在基因和蛋白表達水平提示LPIN1可能在AMPK信號通路中存在潛在作用，未來研究可通過轉基因或基因沉默方法進一步驗證LPIN1和AMPK信號通路之間的確切調控機制。

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