AMPK激活劑抑制PDGF誘導的大鼠血管平滑肌細胞增殖的機制研究*

吳 峻，鄭 婷，童珊珊，李鈺青，佘曉芬，張 萌，肖 云

(廣州醫學院第一附屬醫院心內科，廣東 廣州 510120)

研究表明，各種損傷因子(如血壓、血脂等)可促使血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)分化、增殖并遷移形成新的內膜，這種增殖效應在動脈硬化、血管成形術后再狹窄發生機制中起著重要作用［1］。血小板源性生長因子(plateletderived growth factor，PDGF)是影響血管內皮的常見炎癥因子之一，它有不同的單聚體或多聚體(如PDGF－AA、－BB、－CC等)，可通過不同的受體對不同組織產生不同的效應。PDGF在動脈粥樣硬化發生機制中的作用除了損傷血管內皮外，也可能通過促進VSMCs增殖來實現，其詳盡機制仍在探索中［2，3］。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶 (AMP－activated protein kinase，AMPK)是細胞能量代謝的調節因子，還可能參與細胞基因的轉錄調控，并導致細胞在分裂增殖周期中停滯，從而抑制細胞的增殖［4］。目前有關PDGF和AMPK影響VSMCs的詳盡機制尚未明了，本實驗通過應用AMPK激活劑5－氨基咪唑－4－甲酰胺核糖核苷(5－aminoimidazole－4 －carboxamide－1－β－D－riboside，AICAR)及 PDGF干預VSMCs，初步觀察其作用下VSMCs的增殖變化;并通過檢測AMPK活性對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)表達強度的影響，探討AMPK活化影響VSMCs增殖的可能途徑。

材料和方法

1 試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone);DMEM培養基、1×青霉素－鏈霉素、胰蛋白酶(Gibco);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(Sigma);血小板衍生生長因子－BB(platelet－derived growth factor－BB，PDGF－BB)(Peprotech);AICAR(TRC);p－AMPK抗體(CST);p－mTOR抗體(Bioworld);αactin平滑肌細胞檢測試劑盒(博士德公司);精準定量DNA marker(Trans);RT－PCR試劑盒(TaKaRa);全蛋白提取試劑盒(凱基公司)。儀器:低溫冷凍離心機(Hettich)，SM－F123制冰機(Sanyo)，恒壓恒流電泳儀DYY－III2(北京六一設備廠)，低溫冰箱(Forma Scientific)，VCX750型超聲波細胞粉碎機(Sonic)，核酸定量儀(Eppendorf)，PCR擴增儀(Biometra)，Sunrise酶標儀(Tecan)，電泳及轉膜裝置(Bio－Rad)，凝膠成像及圖像分析系統分析(中國上海天能)。

2 VSMCs的培養

雄性SD大鼠購自廣東實驗動物中心(粵監證字2008A002)，體重200－300 g，戊巴比妥麻醉后引臼處死，無菌狀態取出胸主動脈，采用組織塊貼壁培養法培養，傳代篩選后用α－actin平滑肌細胞檢測試劑盒鑒定細胞，所有實驗均采用4～6代細胞。

3 細胞增殖檢測(MTT法)

取第4代VSMCs以2.5×104接種到96孔板貼壁24 h，饑餓24 h后更換10%胎牛血清的DMEM培養基并加入0.5 mmol/L AICAR，PDGF－BB干預濃度為 10 μg/L，分為:A 組(AICAR)、P 組(PDGF)、A+P組(AICAR+PDGF)和對照組4個組，每組6個復孔，每作用24 h、48 h及72 h前30 min加入MTT 試劑(5 g/L，20 μL)，終點時間加入 200 μL DMSO溶解顆粒，酶標儀在570 nm處記錄數值，每組5個復孔，實驗重復5次。

4 蛋白活性檢測(Western blotting)

4.1 p－AMPK表達檢測 取第4代VSMCs以4×104接種到50 mm細胞培養皿貼壁24 h，饑餓24 h后更換10%胎牛血清的DMEM培養基并加入AICAR 其終濃度0.5 mmol/L。分別在30 min、1 h、3 h、6 h、12h采用凱基全蛋白提取試劑盒，抽提細胞總蛋白，取20 μg以4% ～12%的十二烷基硫酸鈉－聚丙酰胺凝膠(SDS－PAGE，Invitrogen)電泳分離，轉膜后，5%BSA的TBST封閉過夜，Ⅰ抗4℃孵育2 h，Ⅱ抗室溫1 h，ECL試劑盒顯帶分析并測灰度值，實驗重復3次;另取第4代VSMCs以4×104接種到50 mm細胞培養皿貼壁24 h，饑餓24 h后更換10%胎牛血清的DMEM培養基并按不同組加入AICAR濃度0.5 mmol/L，PDGF －BB 濃度10 μg/L，分為:A 組(AICAR)、P組(PDGF)、A+P 組(AICAR+PDGF)和對照組4個組，每組6個復孔，在12 h采用凱基全蛋白提取試劑盒抽提細胞總蛋白，按上述同法處理后檢測各組灰度值，實驗重復3次。

4.2 p－mTOR表達檢測 取第4代VSMCs以4×104種到50 mm細胞培養皿貼壁24 h，饑餓24 h后更換10%胎牛血清的DMEM培養基并加入AICAR其終濃度 0.5 mmol/L。分別在 30 min、1 h、2h、6 h、12 h抽提細胞總蛋白，取20 μg以4% ～12%的SDS－PAGE電泳，進行分析并測灰度值，實驗重復3次;另取第4代VSMCs以4×104接種到50 mm細胞培養皿貼壁24 h，饑餓24 h后更換10%胎牛血清的DMEM培養基并按不同組加入AICAR濃度0.5 mmol/L，PDGF －BB 濃度 10 μg/L，分為:A 組(AICAR)、P 組(PDGF)、A+P組(AICAR+PDGF)和對照組4個組，每組6個復孔，12 h采用凱基全蛋白提取試劑盒抽提細胞總蛋白，按上述同法處理后檢測各組灰度值，實驗重復3次。

5 統計學處理

結 果

1 VSMCs的培養及鑒定

光鏡下可見，傳代培養的第4代細胞呈長梭形，及典型的“峰－谷”樣生長，經免疫組化染色后，可見胞漿內陽性著色的絲狀 α－actin分布，確認為VSMCs，見圖 1、2。

Figure 1.The growth of VSMCs(×200)VSMCs at the 4th passage showed peak－valley－like growth.圖1 平滑肌細胞生長情況

Figure 2.Confirmation of VSMCs(×400).Positive－stained filamentous α － actin in the cytoplasm was obsered.圖2 平滑肌細胞染色確認

2 PDGF及AICAR在不同時點對VSMCs增殖的影響

PDGF 干預24 h、48 h、72 h 后，明顯促進 VSMCs的MTT值升高(P＜0.05);AICAR在不同時點均可以使VSMCs的MTT值顯著下降(P＜0.05)，見表1。

表1 PDGF及AICAR作用不同時間對細胞MTT值的影響Table 1.Effects of PDGF and AICAR on MTT value at different time points(.n=5)

表1 PDGF及AICAR作用不同時間對細胞MTT值的影響Table 1.Effects of PDGF and AICAR on MTT value at different time points(.n=5)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs group P.P:PDGF;A:AICAR;A+P:AICAR+PDGF.

Group 24 h 48 h 72 h Control 0.136 ±0.012 0.188 ±0.016 0.261 ±0.0210.164 ±0.011* 0.253 ±0.011* 0.312 ±0.025*A 0.121 ±0.011* 0.149 ±0.011* 0.188 ±0.017*A+P 0.119 ±0.011*# 0.165 ±0.011*# 0.229 ±0.019*#P

3 AICAR對細胞AMPK的激活作用

AICAR干預細胞，分別在不同時點檢測到p－AMPK的表達，經灰度分析顯示AMPK的激活隨藥物干預時間增加而逐漸增強，見圖3。

Figure 3.Expression of p－AMPK at different time points(Western blotting)..n=3.*P＜0.05 vs control.圖3 不同時點p－AMPK的表達

4 PDGF、AICAR及兩者聯合作用對細胞 p－AMPK的影響

各組干預細胞12 h后分別檢測p－AMPK的表達。與對照組比較，P組灰度值降低、A+P及A組均升高，A+P組高于P組，見圖4。

5 AICAR對磷酸化mTOR(p－mTOR)蛋白表達的影響

對照組細胞可見p－mTOR強表達，AICAR干預后p－mTOR表達活性減弱，隨著藥物干預時間延長，p－mTOR表達減弱更加明顯，見圖5。

Figure 4.Expression of p－AMPK at different groups(Western blotting)..n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs group P.P:PDGF;A:AICAR;A+P:AICAR+PDGF.圖4 p－AMPK在不同干預組的表達

Figure 5.Expression of p－mTOR in different time points(Western blotting)..n=3.*P＜0.05 vs control.圖5 p－mTOR蛋白在不同時點的表達

6 PDGF、AICAR及兩者聯合作用對磷酸化mTOR的影響

各組干預細胞12 h后分別檢測p－mTOR的 表達。與對照組比較，P組灰度值增高、A+P及A組均降低，A+P組低于P組，見圖6。

Figure 6.Expression of p－mTOR in different groups(Western blotting)..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs group P.P:PDGF;A:AICAR;A+P:AICAR+PDGF.圖6 p－mTOR蛋白在不同干預組的表達

討 論

在動脈粥樣硬化的發生、發展過程中，以及冠狀動脈介入治療后都會出現血管增殖性改變，嚴重威脅著治療的進展和疾病的預后，在這一環節中，血管中層平滑肌細胞是否進入周期性的增殖狀態起著關鍵的作用。在正常血管壁完整的情況下，血管壁中層平滑肌細胞處于G0期的穩定狀態，只有在一些刺激因素的作用下(如球囊損傷、PDGF的刺激)，才會觸發其增殖［5］。血管平滑肌細胞的異常增殖成為冠心病急性事件的獨立危險因素，探討其增殖及抑制途徑對于防治急性冠脈事件的發生具有重要意義。

AMPK是一個蘇氨酸激酶，被認為是所有真核細胞的能量感受器，激活的AMPK對腫瘤細胞的生長有強烈抑制作用，其效應主要通過抑制細胞周期、胞內蛋白質合成以及體內脂肪酸和膽固醇的合成過程來實現。本研究顯示，AMPK的激活對血管平滑肌細胞的增殖亦起著顯著的抑制作用(P＜0.05)。

AICAR是被廣泛認可的AMPK激活劑，可能是今后治療缺血性心臟病很有潛力的藥物［6］，AICAR通過腺苷載體轉運到細胞內，在腺苷激酶的作用下被磷酸化形成5’－AMP類似物(zeatin riboside－5’－monophosphate，ZMP)，ZMP 具有 AMP 的類似結構，它可以與γ亞基上的CBS序列結合，引起AMPK的構象改變，同時保護抑制Thr172位點的去磷酸化，在磷酸化的作用下，使AMPK激活［7］。研究發現，在大鼠股動脈的導絲損傷模型中，如果給予AICAR使AMPK能夠持續的激活，血管損傷處新內膜的形成可受到明顯抑制，內皮下平滑肌細胞的增殖也被明顯抑制［8］。本實驗結果顯示，在AICAR作用下p－AMPK的表達強度隨時間變化而逐漸增強，在12 h時達到最高值;PDGF干預后分別檢測p－AMPK，PDGF能抑制對照組AMPK的表達，但AICAR激活作用下PDGF抑制AMPK表達的效應明顯減弱，同時，檢測 MTT值提示:AMPK的激活還可能抑制PDGF誘導的VSMCs增殖效應(P＜0.05)。其機制尚未明了，可能與促進p53的表達上調和磷酸化，使血管平滑肌細胞增殖周期停滯在G1/S階段有關，其抑制增殖的效應主要是通過抑制MAP激酶信號系統實現的［9］。

實驗結果顯示，AMPK激活后，p－mTOR的表達受到明顯抑制，在AMPK激活12 h后，其表達幾乎受到完全抑制，已知PDGF能誘導VSMCs增殖效應，PDGF干預后檢測p－mTOR的 表達明顯增強，但AICAR加PDGF聯合干預后p－mTOR的 表達低于PDGF單獨誘導組，即PDGF對mTOR活性的上調效應被AICAR抑制，進一步提示AMPK激活后的抑制增殖效應可能還與mTOR活性的下調有關，這中間可能同樣存在AMPK/mTOR信號途徑影響VSMCs的增殖。mTOR是細胞內多種重要信號轉導通路的樞紐，調控翻譯起始、轉錄、蛋白合成和降解功能，進而調節細胞的生存、增殖和凋亡等細胞重要生理功能，LKB1/AMPK/mTOR信號通路是其中較經典的信號通路之一，當細胞內AMP/ATP比值增高時，AMP與AMPK亞單位結合引起構象的改變，然后LKB1與AMPK的α亞單位結合引起AMPK磷酸化而激活［10］，激活的AMPK通過使結節性硬化復合體2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)磷酸化來阻斷mTOR的活化［11］。AMPK對 VSMCs的增殖抑制機制可能與mTOR下游的2個重要靶蛋白有關，即核糖體p70S6激酶(S6K1)和4E－BP1，兩者均參與蛋白翻譯的關鍵環節［12］。

綜上所述，實驗結果顯示PDGF對VSMCs有促增殖效應，AICAR干預后可激活AMPK，并顯著抑制PDGF誘導的VSMCs增殖，細胞mTOR活性的下調可能參與了VSMCs的抑增殖效應。

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