葛根素對腎性高血壓大鼠apelin－12、AngⅡ及NO含量與血壓的影響*

黃幀檜，張 培，楊 帆，丁伯平

(皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，中藥藥理國家三級實驗室，安徽 蕪湖 241002)

高血壓是最常見的心血管疾病，會引起嚴重的心、腦、腎并發(fā)癥，威脅人類健康。因此，對于高血壓及其并發(fā)癥治療的研究有著重大意義。在腎性高血壓的發(fā)生機制中，最重要的是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)被異常激活。RAS可調(diào)節(jié)水鈉平衡、血管收縮張力，對腎性高血壓的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。而在RAS中關(guān)鍵因子無疑是血管緊張素Ⅱ(angiotensin II，AngⅡ)。

1998年日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種新的調(diào)節(jié)肽apelin。Apelin的前體由77個氨基酸組成，在體內(nèi)可生成長度不等的多肽片段，常見的有apelin-12、apelin-13、apelin-36。Apelin具有降低血壓、調(diào)節(jié)心臟和舒張血管的功能［1-3］。Apelin與其受體APJ組成系統(tǒng)，該系統(tǒng)與血管緊張素Ⅱ-血管緊張素Ⅱ1型受體(AngⅡ-AT1)系統(tǒng)失衡可能是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要因素［4］。

葛根素來源于豆科植物葛的根，臨床上用于治療冠心病、高血壓等疾病［5］。本實驗室曾觀察葛根素對腎性高血壓大鼠腎臟AngⅡ含量的影響［6］，初步探討過葛根素的降壓機制。但有研究發(fā)現(xiàn)，apelin-36在腎性高血壓的發(fā)生過程中起著重要作用［7-8］。另有研究發(fā)現(xiàn)，apelin-12 比 apelin-36的降壓作用更明顯［9］。本研究以葛根素為腎性高血壓大鼠的治療藥物，觀察其對高血壓發(fā)病的一系列相關(guān)因素——apelin-12、Ang II和一氧化氮(nitric oxide，NO)水平的影響，初步探討其可能的降壓機制。

材料和方法

1 動物

SD大鼠65只，雄性，體重180～220 g。購自南京青龍山實驗動物中心，許可證號SCXK(浙)2008-0033。分籠飼養(yǎng)，每籠1只，保持溫度22℃ ～24℃，濕度60% ～65%，自由進食飲水。

2 藥物

葛根素注射液，山東方明藥業(yè)股份有限公司，批號為H20033292;卡托普利，上海普康藥業(yè)有限公司，批號為H31021327。

3 試劑

AngⅡ放射免疫試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所，批號為20100820;NO試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號為20100919;大鼠apelin-12 ELISA檢測試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號為20110301B。

4 儀器

ALC-NIBP無創(chuàng)尾動脈血壓心率測定系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司);勻漿儀(PRO250);高速低溫離心機22R(Beckman Coulter);HH.S型電熱恒溫水浴鍋(江蘇省醫(yī)療器械廠);GC21500型γ放射免疫計數(shù)器(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);U-2800分光光度計(日立公司);ELx800酶標儀(BioTek)。

5 主要方法

雄性SD大鼠65只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機抽取8只作為假手術(shù)組，其余57只采用兩腎一夾法造成腎性高血壓大鼠模型。以25%烏拉坦(4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，分離左腎動脈、放置內(nèi)徑為0.2 mm的銀夾并打結(jié)固定。假手術(shù)組操作方法同上，但不放置銀夾。術(shù)后3 d連續(xù)給予青霉素4×105U肌注預(yù)防感染。尾袖法測定清醒大鼠術(shù)前、術(shù)后及用藥后動脈壓，術(shù)后4周收縮壓≥160 mmHg者為造模成功［10］，入選腎性高血壓大鼠(renal hypertensive rat，RHR)組。將手術(shù)成功的42只大鼠隨機分成5 組:高(n=9)、中(n=8)、低(n=8)劑量葛根素組分別以及卡托普利組(n=9)、模型組(n=8)。術(shù)后第5周開始給藥，高、中、低劑量葛根素組分別以葛根素100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg腹腔注射;卡托普利組以卡托普利(30 mg/kg)灌胃;假手術(shù)組與模型組以等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥6周，每2周測1次血壓。給藥6周后，在25%烏拉坦麻醉下腹主動脈取血，離心后取上清液待測apelin、Ang II和NO含量。取出右側(cè)腎臟，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗后濾紙吸干，將右腎的一半置入10%中性甲醛中固定;右腎的另一半用勻漿器碾磨3500 r/min 4℃離心10 min，取上清液待測腎臟組織中apelin和AngⅡ水平。用ELISA法測腎臟、血清中apelin-12含量，放射免疫法測定腎臟、血漿中AngⅡ含量，硝酸還原酶法測血清中NO含量。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 各組大鼠動脈壓的改變

各組間大鼠在術(shù)前血壓沒有明顯差異。從表1可知，術(shù)后4周RHR組收縮壓明顯升高，與假手術(shù)組比較有明顯差異(P＜0.01)，RHR組間差異不顯著(P＞0.05)。給藥后葛根素高、中劑量組與卡托普利組有明顯的降壓作用(P＜0.01);葛根素低劑量組在給藥4周后開始出現(xiàn)降壓效應(yīng)(P＜0.05)。隨著葛根素劑量的升高血壓下降越來越明顯。葛根素低劑量組與高劑量組及卡托普利組在各個測壓時點收縮壓均有顯著差異。

表1 各組大鼠不同時期收縮壓變化Table 1.The changes of systolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

表1 各組大鼠不同時期收縮壓變化Table 1.The changes of systolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.Pue:puerarin.

Sham 123.5±8.2 122.4±7.9 124.3±7.8 123.8±6.9 Model 179.4±8.6△△ 182.6±9.5△△ 190.3±9.2△△ 192.4±10.5△△Captopril treatment 30 189.8±11.5△△ 166.4±9.2△△＊＊ 159.7±10.5△△＊＊ 154.7 ±8.9△△＊＊Pue(high)treatment 100 183.4±7.6△△ 162.6±9.7△△＊＊ 157.9±8.7△△＊＊ 153.5 ±10.3△△＊＊Pue(middle)treatment 50 180.6±10.5△△ 169.8±9.2△△＊＊ 162.9±7.3△△＊＊ 159.8 ±8.2△△＊＊Pue(low)treatment 25 182.4±8.8△△ 178.1±9.3△△ 174.6±7.1△△＊ 171.3±9.6△△＊

從表2可知，術(shù)后4周RHR組舒張壓明顯升高，與假手術(shù)組比較差異明顯(P＜0.01)。RHR組間差異不顯著(P＞0.05)。給藥后葛根素高、中劑量組、卡托普利組與模型組比較降壓作用顯著(P＜0.01)。與收縮壓情況類似，給藥4周后低劑量葛根素亦能降低舒張壓(P＜0.05)。高劑量葛根素組與低劑量葛根素組之間有顯著差異(P＜0.05)。

表2 各組大鼠不同時期舒張壓變化Table 2.The changes of diastolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

表2 各組大鼠不同時期舒張壓變化Table 2.The changes of diastolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

Group Dose(mg·kg-1) 4 weeks after operation 2 weeks after administration 4 weeks after administration 6 weeks after administration Sham 89.7±8.2 90.1±6.2 89.4±7.1 91.2±6.7 Model 136.4±8.2△△ 138.6±6.3△△ 137.3±9.1△△ 140.7±10.3△△Captopril treatment 30 135.8 ±7.2△△ 121.4±9.5△△＊＊ 120.7±8.1△△＊＊ 119.6 ±6.1△△＊＊Pue(high)treatment 100 129.8 ±5.9△△ 118.2±7.3△△＊＊ 120.2±5.9△△＊＊ 118.5 ±8.6△△＊＊Pue(middle)treatment 50 130.6 ±9.6△△ 121.1±5.6△△＊＊ 124.5±6.3△△＊＊ 125.8 ±9.1△△＊＊Pue(low)treatment 25 134.7±7.9△△ 130.1±6.9△△ 129.6±8.4△△＊ 128.3±7.3△△＊

2 各組大鼠血清中apelin－12、NO和血漿中AngⅡ含量

從表3可知，葛根素高、中劑量組以及卡托普利組均能有效降低apelin-12和AngⅡ含量，升高NO含量，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。葛根素低劑量組血清中apelin-12含量下降不明顯，但有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。低劑量葛根素對AngⅡ和NO含量沒有明顯影響(P＞0.05)。

3 各組大鼠腎臟中apelin－12和AngⅡ含量

從圖1可知，模型組腎臟中apelin-12含量明顯升高，與假手術(shù)組比較，差異顯著(P＜0.01)。隨著葛根素劑量的升高，腎臟中Apelin-12含量逐漸降低，各葛根素組與模型組比較，均有顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)。

如圖2所示，隨著葛根素劑量的增加，腎臟中AngⅡ含量逐漸減少。葛根素高、中劑量組與模型組比較，有明顯差異(P＜0.01);葛根素低劑量亦能降低腎臟中AngⅡ含量，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠血清中apelin－12、NO和血漿中AngⅡ含量Table 3.Content of apelin-12，NO in serum and AngⅡ in plasma in all groups(.n=8～9)

表3 各組大鼠血清中apelin－12、NO和血漿中AngⅡ含量Table 3.Content of apelin-12，NO in serum and AngⅡ in plasma in all groups(.n=8～9)

△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

Group Apelin-12(ng·L-1)AngⅡ(ng·L-1)NO(mol·L-1)Sham 186.8±11.5 212.3±10.5 52.3±9.5 Model 225.6±9.6△△ 262.1±9.7△△ 35.6±7.9△△Captopril treatment 194.7±8.4＊＊ 225.6±8.3＊＊ 50.3±6.7＊＊Pue(high)treatment 189.3±12.6＊＊ 220.2±10.1＊＊ 51.4±8.8＊＊Pue(middle)treatment 203.1±7.5＊＊ 234.5±11.3＊＊ 46.7±6.9＊＊Pue(low)treatment 212.4±10.3△△＊ 249.1±9.2△△ 41.8±5.2△

Figure 1.Apelin-12 level in kidneys in all groups..n=8～9.△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.圖1 各組大鼠腎臟中Apelin－12的含量

Figure 2.AngⅡlevel in kidneys in all groups..n=8～9.△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.圖2 各組大鼠腎臟中AngⅡ的含量

討 論

腎性高血壓是一種常見的繼發(fā)性高血壓，其主要病因是腎動脈狹窄。由于腎血流量的減少，異常激活RAS［11］，導(dǎo)致鈉、水潴留，引起血壓升高。葛根素具有改善心腦血管循環(huán)、降壓等作用。本實驗室以前的實驗結(jié)果［6］顯示葛根素有明顯的降壓效果。可葛根素劑量與吳文華等［12］報道的偏大，這次所使用的葛根素劑量有所下降，結(jié)果表明，葛根素各劑量組均能有效降低血壓，收縮壓比舒張壓的降低程度更加明顯，而且隨著劑量的增加降壓效果越來越顯著。其降壓幅度與吳文華等實驗結(jié)果基本相同。與本實驗室上次使用的葛根素降壓效果也大致相似，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與動物的性別(上次為雌雄各半，本次均為雄性)、個體差異(不同批次的動物)有關(guān)。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶既可以水解血管緊張素，又可以降解apelin。Apelin雖不能與AT1受體直接結(jié)合，但APJ受體與AT1受體存在著密切關(guān)系，它們既有拮抗作用又有協(xié)同作用。Apelin是小分子活性多肽，在血管［13］、心臟［14-15］、大腦［16］中都有表達。Apelin可以調(diào)節(jié)血管的收縮功能，隨著AngⅡ濃度升高，apelin濃度會相應(yīng)升高，拮抗AngⅡ的升壓作用;AngⅡ濃度降低，apelin濃度也會相應(yīng)降低。目前研究apelin的作用大多測量它在組織器官中的表達水平，本課題組從北京博奧森生物技術(shù)有限公司購買了大鼠apelin-12 ELISA檢測試劑盒，測出血清及腎臟中apelin的含量。結(jié)果表明，模型組與假手術(shù)組比較，前者腎臟及血清中apelin-12含量、腎臟及血漿中AngⅡ含量升高，而血清中NO含量降低。隨著葛根素劑量的增加，降壓效果越來越明顯，同時，腎臟和血漿(或血清)中apelin-12和AngⅡ的含量逐漸降低，血清中NO的含量逐漸升高。這提示apelin-12與AngⅡ之間的相互拮抗作用以及NO的升高對降低血壓起了一定程度的作用。因此，我們認為葛根素對腎性高血壓大鼠的降壓作用與其改變大鼠體內(nèi)apelin-12、AngⅡ和NO的含量及其平衡有關(guān)。但它們之間究竟是如何相互作用及其生理病理意義有待進一步研究。

綜上所述，葛根素對腎性高血壓大鼠具有降壓作用，其作用機制可能與其改變大鼠體內(nèi)apelin-12、AngⅡ和NO的含量及其平衡有關(guān)。

［1］Zeng XX，Wilm TP，Sepich DS，et al.Apelin and its receptor control heart field formation during zebrafish gastrulation［J］.Dev Cell，2007，12(3):391-402.

［2］Ashley EA，Powers J，Chen M，et al.The endogenous peptide apelin potently improves cardiac contractility and reduces cardiac loading in vivo［J］.Cardiovasc Res，2005，65(1):73-82.

［3］柏丹娜，高 延，李紅梅，等.Apelin-13對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓調(diào)節(jié)作用的研究［J］.心臟雜志，2010，22(4):514-516.

［4］Ishida J，Hashimoto T，Hashimoto Y，et al.Regulatory roles for APJ，a seven-transmembrane receptor related to angiotensin-type 1 receptor in blood pressure in vivo［J］.J Biol Chem，2004，279(25):26274-26279.

［5］陳秀芳，雷康福，董 敏，等.葛根素對糖尿病大鼠心肌損傷的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(4):650-655.

［6］張年寶，程慧珍，崔衛(wèi)東，等.葛根素對腎性高血壓大鼠的降壓作用及對腎組織ANGⅡ的影響［J］.中藥藥理與臨床，2010，26(2):26-29.

［7］金 戈，楊鵬麟，龔永生，等.葛根素對兩腎一夾高血壓大鼠apelin及其受體的影響［J］.中國中藥雜志，2009，34(24):3263-3267.

［8］金 戈，楊鵬麟，龔永生，等.葛根素對兩腎一夾高血壓大鼠左心室Apelin/APJ基因表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(11):2478-2480.

［9］Tatemoto K，Takayama K，Zou MX，et al.The novel peptide apelin lowers blood pressure via a nitric oxide-dependent mechanism［J］.Regul Pept，2001，99(2-3):87-92.

［10］Duke LM，Widdop RE，Kett MM，et al.AT2 receptors mediate tonic renal medullary vasoconstriction in renovascular hypertension［J］.Br J Pharmacol，2005，144(4):486-492.

［11］Reinhold SW，Uihlein DC，B?ger CA，et al.Renin，endothelial NO synthase and endothelin gene expression in the 2kidney-1clip Goldblatt model of long-term renovascular hypertension［J］.Eur J Med Res，2009，14(12):520-525.

［12］吳文華，張繼業(yè)，王 宇，等.葛根素影響自發(fā)性高血壓大鼠血壓的機制［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2010，38(4):26-29.

［13］Kasai A，Shintani N，Oda M，et al.Apelin is a novel angiogenic factor in retinal endothelial cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，325(2):395-400.

［14］Zeng XX，Wilm TP，Sepich DS，et al.Apelin and its receptor control heart field formation during zebrafish gastrulation［J］.Dev Cell，2007，12(3):391-402.

［15］Berry MF，Pirolli TJ，Jayasankar V，et al.Apelin has in vivo inotropic effects on normal and failing hearts［J］.Circulation，2004，110(11 Suppl 1):II187-II193.

［16］O'Shea M，Hansen MJ，Tatemoto K，et al.Inhibitory effect of apelin-12 on nocturnal food intake in the rat［J］.Nutr Neurosci，2003，6(3):163-167.