人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織NOS活性及蛋白表達的影響*

王巧云，吳峰階

(1濱州醫學院基礎學院，山東 煙臺 264003;2濱州醫學院臨床學院，山東 濱州 256603)

腦缺血再灌注損傷是一復雜的病理生理過程，有多種因素參與。研究表明，一氧化氮(nitric oxide，NO)在其中發揮正負雙重作用，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO生物合成的限速酶，其類型與NO作用密切相關［1］。人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)是人參的主要提取物之一，也是臨床應用的主要藥理活性成分，具有抗氧化、抗衰老、減輕神經功能損傷的作用，且作為復方制劑的主要成分之一已用于治療腦血管疾病［2-3］。進一步研究發現人參皂苷Rg1能夠抑制NOS活性，對放射性腦損傷具有保護作用［4］。人參皂苷Rg1是否亦通過影響NOS對缺血再灌注損傷腦有保護作用尚未見報道。本實驗采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，研究人參皂苷Rg1對缺血再灌注損傷大鼠腦組織中NO含量以及NOS、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)活性的影響，探討其作用的可能機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SD大鼠(由山東大學動物中心提供，動物合格證號為SCXK魯20030004)，體重(270±30)g，雌雄不拘。

1.2 藥品與試劑 人參皂苷Rg1(南京澤朗醫藥科技有限公司)，nNOS和 iNOS抗體(Cell Signaling Technology);BCA蛋白試劑盒(Bio-Rad);ECL化學發光檢測試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司);所有Ⅱ抗、Ⅲ抗均購自北京中衫金橋生物技術有限公司;測定NO、NOS和iNOS試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 儀器 CM1850恒冷箱冰凍切片機(Leica);TG16MW-臺式離心機(赫西儀器);Max M5酶標儀(Molecular Devices);凝膠成像儀(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 分組與用藥 將大鼠隨機分成5組:(1)假手術組(sham);(2)腦缺血再灌注模型組(cerebral ischemia referfusion，I/R);(3)人參皂苷 Rg1防治組(10 mg/kg、20 mg/kg及40 mg/kg)。各組動物均腹腔注射等容積藥物，1次/d，連續7 d，末次給藥后30 min依法制備腦缺血再灌注模型。假手術組和模型組腹腔注射等容積生理鹽水。

2.2 局灶性腦缺血再灌注模型制備 健康成年SD大鼠，參照Longa等［5］建立的大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。以10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后，頸縱向切口，分離右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)，頸內動脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動脈(external carotid artery，ECA)。在 ECA發出約 0.8 cm處結扎，于CCA近心端夾一動脈夾，在ECA結扎處與分叉處之間做一直徑約2 mm的“V”形切口，將尼龍線(內徑為0.26 mm，頂端制成直徑為0.34 mm的光滑圓球)自切口處經頸內、頸外動脈分叉部進入頸內動脈，插入深度約(18.5±0.5)mm至微感阻力，使尼龍線頭端通過MCA起始處，到達較細的大腦前動脈，此時即實現右側大腦中動脈的血流阻塞，結扎ICA以固定尼龍線和防止出血，逐層縫合。缺血2 h，拔出尼龍線至CCA，再灌注24 h。術中術后室溫控制在23～25℃，以電熱毯保暖以保持大鼠直腸體溫在(37±0.5)℃。

假手術組僅把尼龍線插入CCA中1～2 cm，不達到大腦中動脈位置。

2.3 神經功能評分 動物蘇醒后，放回鼠籠，自由飲食，腦缺血再灌注后4 h及24 h，由1名不了解分組情況的觀察者評估記錄神經功能障礙評分。評分標準采用Longa's法［5］:0分，無功能障礙;1分，不能伸展左側前肢;2分，向左側旋轉;3分，向左側傾倒;4分，無自主活動伴意識抑制;5級，死亡。取4 h評分為1～3分大鼠用于實驗。

2.4 病理標本收集 完成神經功能障礙評分后，以10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，依次剪開皮膚，胸腔，充分暴露心臟，剪開左側心尖部，以灌注針朝主動脈方向插入，止血鉗夾閉，于右心耳下部剪開右心房，緩慢推注生理鹽水100 mL，至流出液變清，換用4%多聚甲醛PBS液繼續緩慢推注200 mL，至動物全身僵硬，肝臟發白為止，然后斷頭取腦，用刀片切去前部端腦和后部小腦，放入10%甲醛繼續固定，石蠟包埋，在海馬區做5 μm腦切片，尼氏染色。

2.5 NO、NOS及iNOS測定 MCAO后24 h，精確切取大腦中動脈支配的區域，稱重，按腦組織與生理鹽水的質量體積比為1∶9勻漿，離心后取上清液，測定NO、NOS及iNOS。NO以硝酸還原酶法測定;iNOS、NOS應用比色法測定。操作按說明書進行。

2.6 Western blotting檢測nNOS和iNOS的表達MCAO后24 h，取海馬凍存于液氮中備用。各組動物凍存的標本取0.1 g，加入裂解緩沖液約0.3 mL，用玻璃勻漿器勻漿，冰上裂解30 min;12000 r/min 4℃離心20 min;收集上清。取少量上清以BCA法定蛋白濃度，調整蛋白含量為 50 μg/30 μL，后加入loading buffer，煮沸10 min，冷卻分裝，置于低溫冰箱保存，2周內使用。按實驗室常規上樣、電泳、轉膜后，加入5%TBST-BSA中37℃封閉2 h。加入Ⅰ抗(iNOS和nNOS，稀釋度為1∶1000)37℃搖床孵育2 h，0.1%TBS-T洗膜，10 min/次×3;Ⅱ抗(生物素標記的山羊抗兔或馬抗小鼠IgG，稀釋度為1∶1000)37℃搖床孵育0.5 h，0.1%TBS-T洗膜10 min/次 ×3;Ⅲ抗(辣根酶標記鏈霉卵白素，稀釋度1∶1000)，加入ECL免疫印跡檢測試劑，以 ECL成像系統 (Fujiflm LAS-3000)拍照，以Quantity One凝膠分析系統進行灰度分析，并與內參照(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)比較，進行半定量。

3 統計學處理

結 果

1 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經功能障礙評分和錐體細胞存活的影響

如表1所示，神經功能障礙評分，模型組與假手術組相比明顯增高(P＜0.01);預先給予人參皂苷Rg1后，神經障礙評分明顯降低，與模型組比較有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)。尼氏染色結果顯示，假手術組海馬CA1區有3～4層錐體細胞，排列整齊、緊密，高倍鏡下細胞核大而圓，有1～2個核仁。腦組織缺血損傷后，海馬區神經細胞受損嚴重，CA1區失去正常結構，細胞排列散亂，細胞數量減少。部分神經元皺縮，核固縮、深染，呈三角形、長條形、梭形或不規則形，核染色質聚集，核仁不清晰，見圖1。定量結果顯示，人參皂苷Rg1(20 mg/kg、40 mg/kg)能夠改善缺血神經細胞形態，減少神經細胞的丟失，與溶劑組相比具有顯著差異(P＜0.05)，提示其對急性缺血再灌注損傷大腦具有保護作用，見表2。

表1 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經功能障礙評分的影響Table 1.The effect of ginsenoside Rg1 on neurological deficit scores in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury(n=8)

Figure 1.The effects of Ginsenoside Rg1 on pyramidal neurons of hippocampus CA1 area in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury(Nissel staining，× 400).A:sham group;B:I/R group;C:ginsenoside Rg110 mg/kg group;D:ginsenoside Rg120 mg/kg group;E:ginsenoside Rg140 mg/kg group.圖1 人參皂苷Rg1對海馬CA1區錐體細胞存活數的影響

表2 人參皂苷Rg1對腦缺血再灌注損傷后大鼠海馬CA1區錐體細胞存活數的影響Table 2.The effects of ginsenoside Rg1 on pyramidal cells of hippocampus CA1 area in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury(.n=8)

表2 人參皂苷Rg1對腦缺血再灌注損傷后大鼠海馬CA1區錐體細胞存活數的影響Table 2.The effects of ginsenoside Rg1 on pyramidal cells of hippocampus CA1 area in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury(.n=8)

△△P ＜0.01 vs sham;＊＊P ＜0.01 vs I/R.

Group Number of pyramidal cells Sham 67±6 I/R 23 ±3△△I/R+ginsenoside Rg110 mg/kg 31 ±4＊＊I/R+ginsenoside Rg120 mg/kg 43 ±4＊＊I/R+ginsenoside Rg140 mg/kg 47±7＊＊

2 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織NO含量及NOS、iNOS活性的影響

如表3所示，模型組大鼠MCAO缺血再灌注后，NO含量及NOS、iNOS活性高于對照組(P＜0.01);經人參皂苷Rg1預處理后，NO含量及NOS、iNOS活性有不同程度下降，與模型組比較顯著差異(P＜0.05，P ＜0.01)。

3 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬區iNOS及nNOS的影響

如圖2免疫印跡結果所示，假手術組大鼠海馬nNOS和iNOS蛋白表達較低。模型組大鼠nNOS和iNOS含量增高;人參皂苷Rg120、40 mg/kg組nNOS和iNOS蛋白含量顯著降低，與模型組比較顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)。以GAPDH為內標，對 nNOS和iNOS的表達進行量化，可以直觀地看出人參皂苷Rg1對以上蛋白表達的抑制作用，見表4。

表3 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織NO含量及NOS、iNOS活性的影響Table 3.The effects of ginsenoside Rg1 on the level of NO and the activity of NOS and iNOS in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury(.n=6)

表3 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織NO含量及NOS、iNOS活性的影響Table 3.The effects of ginsenoside Rg1 on the level of NO and the activity of NOS and iNOS in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury(.n=6)

△△P ＜0.01 vs sham;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs I/R.

Group NO(mmol/g protein) NOS(103U/g protein) iNOS(103U/g protein)Sham 2.14±0.16 1.68±0.19 0.26±0.03 I/R 4.89±0.28△△ 3.02±1.02△△ 1.97±0.14△△I/R+ginsenoside Rg110 mg/kg 3.85±0.22* 2.65±0.55 1.62±0.09*I/R+ginsenoside Rg120 mg/kg 3.50±0.21* 2.31±0.13* 1.44±0.12*I/R+ginsenoside Rg140 mg/kg 3.02±0.24＊＊ 2.01±0.15＊＊ 1.19±0.11＊＊

Figure 2.The effects of ginsenoside Rg1 on protein expression of NOS induced by cerebral ischemia-reperfusion injury detected with Western blotting.A:sham group;B:I/R group;C:ginsenoside Rg110 mg/kg group:D:I/R+ginsenoside Rg120 mg/kg group;E:I/R+ginsenoside Rg140 mg/kg group.圖2 人參皂苷Rg1對海馬組織中nNOS和iNOS表達的影響

表4 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血側海馬組織中nNOS和iNOS表達的影響Table 4.The effects of ginsenoside Rg1 on the expression of nNOS and iNOS induced by cerebral ischemia-reperfusion injury(.n=6)

表4 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血側海馬組織中nNOS和iNOS表達的影響Table 4.The effects of ginsenoside Rg1 on the expression of nNOS and iNOS induced by cerebral ischemia-reperfusion injury(.n=6)

△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs sham;*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs I/R.

Group iNOS nNOS Sham 1.00±0.00 1.00±0.00 I/R 1.77±0.28△△ 1.26±0.26△I/R+ginsenoside Rg110 mg/kg 1.46±0.23* 1.21±0.21 I/R+ginsenoside Rg120 mg/kg 1.32 ±0.24＊＊ 1.09 ±0.11*I/R+ginsenoside Rg140 mg/kg 1.24 ±0.20＊＊ 0.97 ±0.13*

討 論

NOS是合成NO的關鍵酶，目前已經確定的有3種亞型:第1種是神經元型(nNOS)，第2種為內皮型(eNOS)，二者屬結構型(cNOS)，在生理狀態下即有表達。它們的激活均依賴于鈣離子和鈣調蛋白的作用。其中，由eNOS產生的NO主要通過擴張血管，增加腦血流量起到保護作用;nNOS來源的NO在缺血早期產生神經毒作用，但nNOS半衰期短，產生的NO量少，對神經系統的毒性作用相對較小。第3種為誘導型(iNOS)，在生理條件幾乎不存在或水平極低，其表達為非鈣依賴性，可由炎癥因子、內毒素等誘導激活，iNOS作用時間長，可催化生成大量NO［6］。過量合成的NO可通過介導興奮性氨基酸的毒性、生成大量氧自由基、引起鈣超載、損傷線粒體、直接損傷DNA及誘導細胞凋亡等加重缺血腦損傷［7］。因此，iNOS被認為是一種“病理型”的酶。

近年研究表明，在腦缺血再灌注損傷過程中，NOS是決定NO發揮損傷或保護雙重作用的關鍵。腦缺血后NOS活性在缺血各時期均有增高，但在缺血損傷的不同階段，不同類型的NOS發揮不同的功能作用。腦梗死超早期(＜2 h)，eNOS活性升高，產生NO在局部擴張腦血管，增加腦血流，發揮腦保護作用，但超過2 h則作用消失。腦梗死早期(2～6 h)，nNOS產生大量 NO發揮毒性作用，當腦梗死晚期(＞6 h)，iNOS產生的 NO可加劇谷氨酸毒性，導致遲發性神經元損傷［8］，尤其 iNOS與鈣調蛋白結合緊密，產生大量的NO，更加劇了遲發性神經元死亡。據劉巍等［9］報道，腦缺血再灌注損傷時，cNOS在缺血再灌注早期被誘導表達，其活力在再灌注6 h后達到高峰，再灌注9 h，cNOS迅速下降，到再灌注24 h，保持在較低水平。而在這個時刻，iNOS迅速達到高峰，并在此后一直到24 h都保持較高水平表達，同時高水平的iNOS導致腦梗死體積增加。

本實驗結果顯示，腦缺血再灌注損傷后，模型組大鼠腦組織中NO含量、NOS及iNOS活性均明顯上升，提示NO的增加可能來源于nNOS和iNOS的活性增高，而升高的 NO與 NMDA受體結合使大量Ca2+通道開放，胞漿內Ca2+明顯升高，引起細胞內鈣超載，促發損傷級聯反應。隨著缺血再灌注損傷的發展和炎癥細胞的浸潤，以及腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β等細胞因子表達增加，可誘導 iNOS產生增多，從而介導神經毒性作用，導致神經元進一步損傷［10］。

本研究表明，人參皂苷Rg1能夠抑制損傷腦組織中總NOS的活性，抑制NO的過量產生，從而降低腦缺血再灌注損傷后的神經功能障礙評分，增加海馬CA1區錐體細胞存活數，對腦缺血細胞起到保護作用。其可能作用機制是通過抑制體內總NOS活性，尤其是再灌注損傷后高表達的iNOS活性，從而減少NO的過量生成實現的。同時，高劑量治療組的療效明顯優于低劑量治療組。

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