MMP3在早期骨關節炎模型軟骨下骨的表達及其意義*

張榮凱，方 航，盧華定，陳郁鮮，宋炎成，曾 春，趙 慶，蔡道章△

(1中山大學附屬第五醫院骨科1區，廣東 珠海 519000;2中山大學附屬第三醫院關節外科，廣東 廣州 510630)

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是一種退變性關節疾病，主要是關節軟骨的退變降解，表現為進行性軟骨變薄、纖維化、糜爛、裂隙、肉眼下潰瘍及全層關節面消失等，并涉及關節的其它組織，包括關節的滑膜、軟骨下骨及肌肉、韌帶等結構的改變［1］。以往對OA的病因研究多集中于關節軟骨的破壞，目前越來越多的研究表明，軟骨下骨改變在OA發病過程中起著積極作用，軟骨下骨改變有可能先于關節軟骨的變化［2－3］。最近研究表明，破骨細胞在早期骨關節炎疾病進程中起了重要作用，在骨關節炎早期，軟骨下骨的破骨細胞活動增強，從而導致骨吸收作用明顯強于成骨作用，進而引起軟骨下骨的骨量丟失，骨質量下降。在軟骨下骨的骨吸收作用中，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)起了重要的作用，可降解關節中的骨基質，特別是破骨細胞表達的基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP3)可能在軟骨下骨的骨吸引中起重要作用［4－5］。然而，有關早期骨關節炎軟骨下骨MMP3表達的研究在國內外報道極少。本研究利用大鼠膝關節骨關節炎模型，首次從基因及蛋白水平全面研究早期骨關節炎軟骨下骨的MMP3表達情況，為闡述其在骨關節炎致病機制中的重要作用提供依據，有利于OA的早期診斷和治療。

材料和方法

1 動物選擇與分組

選取大小、體重相似(10周齡，體重300～325 g)的雄性SD大鼠60只，由中山大學動物實驗中心提供，并飼養于該實驗中心SPF級屏蔽環境中，大鼠分籠飼養，自由飲水和進食。動物房溫度(23±3)℃，相對濕度(60±5)%，每天照明12 h。大鼠編號后，隨機分為對照組(n=30)和實驗組(n=30)。

2 主要的試劑及儀器

MMP3多克隆抗體(Abcam);山羊抗鼠IgGⅡ抗(DAKO)，DAB顯色液(康為世紀)，蛋白酶 K(Sigma)，EDTA(Sigma)，蘇木素(Sigma)，E.Z.N.A.? Tissue RNA Kit(Omega Bio－Tek)，All－in－OneTMqPCR Mix(GeneCopoeia)，Allin－OneTMqPCR Primer(GeneCopoeia)，SX手術顯微鏡(安信化學儀器制造有限公司)，電動磨鉆(Strong 90，New Power)，石蠟切片機(Leica)，光學顯微鏡(Leica DMI 3000 B)，iQ5 Real－Time PCR Detection System(Bio－Rad)，分光光度計(ND －1000，Thermo Scientific)等。

3 大鼠膝關節骨關節炎模型的建立

實驗組大鼠用10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔內注射麻醉后，選取右膝關節，去毛后，常規消毒鋪巾，依次切開皮膚、膝關節囊，行“內側副韌帶切斷+內側半月板切除”，用5－0可吸收線獨立縫合關節囊，以5－0絲線間斷縫合傷口。術后肌注1次青霉素40000 U抗感染，待麻醉蘇醒后腹腔注射曲馬多(10 mg/kg)止痛。同樣的方法處理對照組大鼠，但不切斷內側副韌帶，也不切除內側半月板。

4 標本獲取及處理

4.1 標本的初步處理 于術后1、2、4周分別隨機抓取大鼠，對照組、實驗組各10只。于每一時點，對照組、實驗組各5只解剖分離右膝關節，在解剖顯微鏡下對膝關節面進行觀察，大體觀察后立即將骨組織置10%多聚甲醛4℃固定保存。另5只分離出膝關節后將股骨髁從骺板處折斷后立即將股骨髁放入液氮保存，用于進一步分離軟骨下骨組織及提取骨RNA。

4.2 標本的進一步處理 膝關節標本置10%多聚甲醛4℃固定48 h后，放入20%EDTA液于4℃冰箱內脫鈣4周，每3 d換脫鈣液1次。常規脫水、浸蠟后包埋，沿膝關節矢狀面切片，每隔300 μm切片1次，每張切片厚度5 μm，行蘇木精－伊紅(HE)及番紅O－固綠(Safranin O－fast green)染色進行組織學觀察。

4.3 軟骨下骨的分離及其RNA的提取 將保存于液氮下的股骨髁拿出，放入液氮容器內并固定，使用微動力磨鉆于液氮保護下打磨清除關節軟骨及骺板組織，操作中使用手術顯微鏡確保完全清除其它組織。將分離得到的軟骨下骨放入液氮研磨器中，將骨塊研磨成粉末后，使用E.Z.N.A.? Tissue RNA Kit，按試劑盒操作說明提取軟骨下骨RNA，用分光光度計法及瓊脂糖凝膠電泳法鑒定RNA的質量。

5 實時熒光定量PCR

采用染料法(SYBR Green I)進行相對定量分析，按照ΔΔCt解析法來進行實驗設計，以GAPDH作為內參照基因。MMP3上游引物 5'－CGGTGGCTTCAGTACCTTTC －3'，下游引物5'－ACCTCCTCCCAGACCTTCA－3'。標本 RNA反轉錄、qPCR反應體系建立實驗步驟按試劑盒說明操作。PCR反應條件，采用了標準的三步法程序進行反應:95℃預變10 min 1個循環;95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，40個循環。

6 免疫組化檢測

每塊骨組織連續切取5張切片(每張厚度5 μm，相距300 μm)行免疫組化染色:采用SABC(鏈霉親和素生物素酶復合物)法，陰性對照以PBS代替Ⅰ抗，以人乳腺癌組織切片為陽性對照。切片常規脫蠟，水化，用3%H2O2避光封閉15 min，檸檬酸高溫高壓8 min和蛋白酶K修復抗原后，加MMP3Ⅰ抗4℃下孵育過夜，將帶辣根過氧化酶Ⅱ抗37℃下孵育20 min，DAB溶液光鏡下控制顯色，漂洗后蘇木素復染、脫水、透明，中性樹脂封片，切片置于40倍顯微鏡下觀察切片。

7 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差()，均數比較采用t檢驗，α=0.05。

結 果

1 SD大鼠膝關節骨關節炎模型的成功建立

1.1 術后膝關節大體標本觀察結果 術后1周，實驗組與對照組與股骨髁軟骨面光滑如常，關節面無破損;術后2周，實驗組股骨內側髁與脛骨內側平臺軟骨表面稍顯粗糙，極少關節面見輕微糜爛，外側股骨髁光滑如常;術后4周，實驗組雙側股骨髁均見明顯的軟骨面輕度糜爛，部分關節潰瘍磨損，而且內側股骨髁比外側更嚴重，無骨贅形成。

1.2 術后膝關節病理切片觀察結果 術后1周，實驗組與對照組軟骨表面光滑平整，細胞數目和軟骨細胞排列無明顯差異，番紅O－固綠染色不均勻，特別是表層染色減退，但潮線尚完整，見圖1A、B、G、H;術后2周，軟骨表面見較多裂隙，有的甚至伸入輻射層，軟骨細胞數量明顯增多，結構開始有點紊亂，可見軟骨細胞簇集，表層細胞變圓及其片狀剝脫現象，軟骨破壞較重的關節面可見表層軟骨變薄，部分關節面纖維組織覆蓋，見圖1C、D、I、J;術后4周，看見局部表面，軟骨細胞脫落消失，直到鈣化層和軟骨下骨交界處，此處表層覆蓋大量的纖維素，細胞數目整體明顯增多，細胞簇集現象明顯，見圖1E、F、K、L。

Figure 1.Histological analysis of cartilage degradation at each time point post－surgery(×20).A，C，E，G，I，K:sections stained with HE;B，D，F，H，J，L:sections stained with safranin O － fast green.Scale bar=100 μm.圖1 實驗組與對照組標本切片蘇木精－伊紅(HE)及番紅O－固綠染色

以上觀察結果表明:以“內側副韌帶切斷+內側半月板切除”造成的膝關節不穩，大鼠膝關節骨關節炎表現隨著術后時間進展，關節面的損傷慢慢加重，本實驗成功建立大鼠膝關節骨關節炎模型［6］。

2 軟骨下骨RNA提取結果

實驗組與對照組股骨髁標本，用液氮下微動力磨鉆打磨的方法分離得到的軟骨下骨，進一步提取的骨RNA濃度為(357.71±157.74)mg/L，A260/A280值為2.030±0.014;瓊脂糖凝膠電泳法對每個標本RNA分析顯示:RNA電泳條帶清晰，28S∶18S約為2∶1，表明RNA完整無降解。以上結果表明:本方法在分離軟骨下骨時能有效避免骨RNA的降解，確保得到高質量的骨RNA用于后繼的qPCR實驗。

3 軟骨下骨MMP3 mRNA的表達量分析結果

實時熒光定量PCR結果示:實驗組與假手術組相比較，在術后1周，軟骨下骨的MMP3在實驗組的表達量明顯升高，是對照組的8.34倍(P＜0.05);術后2周，MMP3在實驗組的表達量也升高，是對照組的4.85倍(P＜0.05)，但相對于術后1周，表達量有所下降;術后4周，2組的MMP3表達量無差異表達，見圖2。以上結果表明，軟骨下骨中的MMP3在極早期骨關節炎的表達量明顯增加，提示了MMP3在極早期骨關節炎的軟骨下骨中可能起了重要的作用。

4 軟骨下骨的MMP3免疫組化結果

如圖3所示，術后1、2周，實驗組軟骨下骨區檢測到大量的MMP3陽性細胞，以小單核細胞及多核巨細胞為主，其中多核巨細胞胞漿MMP3陽性較明顯;特別在靠近骨小梁區，破骨細胞樣MMP3陽性多核巨細胞明顯增多。而且，術后1周陽性細胞比例明顯高于術后2周，陽性的強度也較高。術后4周實驗組、對照組及陰性對照組織切片均未檢測到MMP3陽性細胞。免疫組化檢測結果從蛋白水平驗證了早期骨關節炎軟骨下骨MMP3的表達，而且與熒光定量PCR的結果相一致。

Figure 2.MMP3 mRNA expression detected by real－time PCR at each time point.*P ＜0.05 vs control group.圖2 實驗組與假手術組軟骨下骨MMP3 mRNA的表達

討 論

軟骨下骨改變在OA發病過程中起著積極作用，特別是與關節軟骨緊靠的軟骨下骨，其與軟骨的相互作用可能也越密切。研究早期OA的軟骨下骨改變對于OA的早期診斷、早期治療有著重大意義［7］。軟骨下骨包括軟骨下骨板以及緊靠其下方的骨小梁、血管和小梁間的腔隙，在OA病例中，常可以觀察到軟骨下骨硬化、囊性化、無菌性壞死等改變［8］。有研究表明軟骨下骨中產生的炎癥因子，可改變軟骨細胞的代謝，進而引起關節軟骨破壞及進行性惡化［9－10］。

Figure 3.Immunohistochemical staining of MMP3 in subchondral bones(A，C，E，G，I，K)and polynuclear giant cells(B，D，F，H，J，L)in experimental group and control group at each time point post－surgery(×40).圖3 軟骨下骨MMP3免疫組化圖

然而，目前缺乏早期骨關節炎軟骨下骨活體組織的相關研究報道，其原因主要是:(1)獲取合適的早期OA的人軟骨下骨標本十分困難，而研究晚期OA的軟骨下骨標本因硬化、囊性變等晚期改變導致難以推斷其早期的分子機制;(2)利用細胞培養技術研究的破骨細胞及成骨細胞的功能容易受培養環境影響，并不能真正地反映活體組織軟骨下骨細胞功能改變;(3)獲取能用于后繼研究的高質量軟骨下骨RNA難度較大。因此，本實驗設計使用的SD大鼠膝關節骨關節炎模型，結合首創的液氮下微動力磨鉆打磨分離膝關節軟骨下骨的方法，有效避免了軟骨下骨RNA的降解，很好地解決以上矛盾，是軟骨下骨基因表達相關研究值得推廣的方法。

本骨關節炎動物模型與其它動物模型相比，具有體積小、價廉、易飼養、解剖及生理學特點與人類相似的特點。有研究表明，使用前交叉韌帶+內側半月板切除建立的膝關節骨關節炎模型在術后4周與人類的早期膝關節骨關節炎，特別是創傷后(如半月板損傷、交叉韌帶損傷等)膝關節骨關節炎，在病理、病生以及形態學改變等方面極為相似［6，11］，更重要的是大鼠的基因組已明確，可以利用該動物模型從基因水平研究軟骨下骨在骨關節炎疾病進程不同時點的分子機制。

MMP3屬于基質溶解酶，廣泛參與包括蛋白聚糖、纖維結合蛋白、層黏連蛋白、凝膠、Ⅳ型膠原和Ⅸ型膠原等各種細胞外基質的降解過程，是破骨細胞骨吸收作用的重要因素之一。Hayami等［6］研究指出本動物模型在術后2周軟骨下骨骨量明顯減少，本研究中，關節不穩定因素導致膝關節的應力改變是唯一的實驗因素，這一因素啟動了軟骨下骨表達MMP3，MMP3參與骨基質的降解，導致骨量減少并在術后2周引起了形態學改變，這個實驗結果與其他學者研究的結果相似［5］。有趣的是，Shibakawa等［4］利用人類晚期膝關節骨關節炎標本，用免疫組化技術在緊靠鈣化軟骨層的軟骨下骨部位也檢測到MMP3的高表達，并指出MMP3的表達進一步引起了關節軟骨的退變，提示了本實驗結果與人類骨關節炎疾病極為相似。但是，本實驗只研究了早期骨關節炎軟骨下骨MMP3的表達，缺乏在更早期及更晚期的軟骨下骨MMP3表達信息;此外，MMP3的基因及蛋白表達是如何調控的，目前尚不清楚，這些都值得進一步深入研究。

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