氨甲酰化促紅細胞生成素抗大鼠慢性心力衰竭的實驗研究

，志祿

(1蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000;2蘭州大學第一醫院;3保定市第二醫院)

近年許多研究表明促紅細胞生成素(EPO)具有心、腦、腎、視網膜等組織器官保護作用，EPO的衍生物氨甲酰化促紅細胞生成素(CEPO)同樣具有組織保護作用，且無造血功能，因而大大降低了高血壓、血栓形成等風險的發生率，但其是否具有抗慢性心力衰竭(CHF)的作用尚未見報道。2010年3～4月，我們建立大鼠CHF模型，予以CEPO干預，通過觀察血流動力學、血清誘生型一氧化氮合酶(iNOS)及超氧化物歧化酶(SOD)等指標，探討其是否具有抗CHF的作用及其可能的機制，為防治CHF提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性清潔級Wistar大鼠90只，購自蘭州大學醫學實驗動物中心，體質量(200±20)g。室內單獨分籠常規飼料喂養，自由飲用紫外線消毒自來水，給予標準照明及通風條件。

1.2 主要試劑、藥品 NOS(分型)測定試劑盒、SOD測定試劑盒(南京建成科技有限公司)，鹽酸異丙腎上腺素注射液(ISO，上海禾豐藥業有限公司)，CEPO(Warren Pharmaceuticals公司)。

1.3 實驗分組、造模及給藥 隨機選取12只大鼠作為對照組，剩余78只腹腔注射 ISO 5 mg/kg，1次/d，連續3 d造模［1］，對照組同期腹腔注射等量生理鹽水。喂養5周后，造模大鼠死亡11只。其中腹腔注射ISO 后第1、2、3天分別死亡5、3、2只，其后喂養期間死亡1只;對照組大鼠無死亡。對存活大鼠進行造模成功判定，以左室舒張末壓(LVEDP)≥15 mmHg提示CHF模型構建成功［2］。剔除造模失敗、術中意外死亡及術后死亡大鼠，共有24只大鼠造模成功，隨機再分為干預組(n=12)及心衰組(n=12)。干預組腹腔注射 CEPO 50 μg/kg［3］，2 次/周，持續4周［4］，心衰組及對照組同期腹腔注射等量生理鹽水，干預4周后進行實驗指標的測定。CEPO干預期間，干預組大鼠無死亡，心衰組大鼠死亡1只，死因可能為心衰加重，對照組大鼠死亡1只，經解剖檢驗死因為腸粘連。腹腔注射時均注意回抽，避免入血管、膀胱及腸管。

1.4 檢測指標 干預4周后，于最后1次給藥后禁食水12 h，稱重，穿刺右側頸總動脈，并置入內含0.1%肝素、直徑1 mm、末端帶有微壓力傳感器的聚乙烯導管，連接BL-410S生物機能實驗系統，記錄血流動力學指標，包括心率(HR)、LVEDP、左室內壓峰值(LVSP)、左室內壓上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。血流動力學指標測定完成后，于右側頸總動脈插管處留取血樣本2 ml置于抗凝管中，室溫靜置15 min后，于常溫下3 000 r/min離心10 min，留取上清液，置入－70℃冰箱備用。按試劑盒說明檢測血清iNOS、SOD水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用一維方差分析。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 一般情況 實驗全程對照組大鼠飲食正常、行動自如、毛色光澤，心衰組及干預組大鼠先后出現精神不振、活動懶散、進食減少及毛枯無澤、散亂豎起等心力衰竭癥狀，嚴重者還出現脫毛、口唇及足趾發紺、行走不穩等癥狀。但干預組大鼠CEPO干預后心衰癥狀較心衰組有所改善。

2.2 血流動力學變化 見表1。

表1 各組大鼠血流動力學指標比較(±s)

表1 各組大鼠血流動力學指標比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與心衰組比較，△P ＜0.05

組別 n LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)－dp/dtmax(mmHg/s)HR(次/min)對照組 11 140.91±6.83 5.14±1.11 3 963.54±178.83 －3 999.62 ±119.25 329.31 ±12.14心衰組 11 110.52 ±8.85* 20.37 ±1.34* 2 570.86 ±184.12* －3 253.47 ±196.71* 417.17 ±13.23*干預組 12 125.34 ±8.72＊△ 12.57 ±1.25＊△ 3 062.78 ±149.24＊△ －3 584.53 ±172.86＊△ 390.83 ±12.38＊△

2.3 血清iNOS及SOD水平測定 與對照組相比，心衰組及干預組血清iNOS水平顯著升高(P＜0.05)，而 SOD 水平顯著降低(P ＜0.05);與心衰組相比，干預組血清iNOS水平顯著降低(P＜0.05)，而SOD水平顯著升高(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清iNOS及SOD水平比較(U/ml，±s)

表2 各組大鼠血清iNOS及SOD水平比較(U/ml，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與心衰組比較，△P ＜0.05

組別 n iNOS SOD對照組11 8.58 ±0.91 56.80 ±2.62心衰組 11 29.73 ±0.99* 44.16 ±3.88*干預組 12 21.23±1.49＊△ 50.96±3.43＊△

3 討論

CHF是多種心血管疾病的最終轉歸，嚴重威脅著人類的健康，預后不良，心衰的5年生存率與惡性腫瘤相仿［5］。因此，防治CHF具有非常重要的意義。CHF的病理生理改變十分復雜，其中神經內分泌紊亂和心室重塑是CHF最主要的發病機制，而心肌細胞過度凋亡引起的心肌細胞丟失及氧自由基(OFR)水平過高在CHF的發生、發展過程中起著重要的作用。其中NO除具有血管擴張效應、抗平滑肌細胞增殖、抗血小板聚集和黏附等作用外，還有細胞毒性及作為炎癥介質等作用。在體和離體研究發現，低濃度NO能增加心肌收縮力，而高濃度NO則抑制心肌收縮力。NO合成的關鍵酶一氧化氮合成酶(NOS)分為兩型，即原生型一氧化氮合成酶(cNOS)和iNOS。Saito等通過在大鼠急性心肌梗死模型中應用選擇性iNOS抑制劑S-methylisothiourea(SMT)證實了iNOS在心臟結構和功能方面的負性作用［6］。cNOS主要參與抑制左室重構及左室功能異常［7］。

CHF時iNOS高度表達，而cNOS降低，NO水平明顯增高，高濃度NO可損害線粒體能量代謝、抑制細胞增殖、破壞DNA結構、促進心肌細胞凋亡;另外，NO還具有細胞毒性作用，可以影響細胞代謝，干擾細胞呼吸鏈和酶的活性，激活使DNA降解的核酶，從而直接啟動細胞凋亡，進而惡化CHF。OFR是機體內一類活潑的不穩定基團，可與細胞膜及細胞器膜的多價不飽和脂肪酸發生過氧化反應，導致細胞損傷。在生理情況下OFR產生與消除處于動態平衡。這種平衡一旦被打破，過高的OFR水平將會造成細胞結構和功能的受損，進而導致機體代謝紊亂。尤其是過高的OFR還可以損傷血管內皮細胞，暴露內皮下膠原，吸引血小板黏附、集聚，并使血管舒張因子合成減少、活性減弱，造成血管過度收縮，加速CHF的進程。而SOD是體內清除OFR最主要的酶，其活力的高低間接反映機體清除OFR的能力。

本實驗結果表明，CEPO可明顯改善CHF大鼠血流動力學指標，升高LVSP及±dp/dtmax并降低LVEDP及HR。因此，CEPO可以改善CHF大鼠心功能。同時，CEPO干預組具有降低血清iNOS水平，升高SOD水平的作用。提示CEPO可能通過抑制過度的NO釋放及清除OFR來改善CHF大鼠的心功能，從而發揮其抗CHF作用。本研究為治療CHF提供了新的干預方法和科學依據，為開發CEPO的新用途奠定了新的理論基礎。

［1］Krenek P，Kmecova J，Kucerova D，et al.Isoproterenol-induced heart failure in the rat is associated with nitric oxide-dependent functional alterations of cardiac function ［J］.Eur J Heart Fail，2009，11(2):140-146.

［2］Tonnessen T，Christensen G，Oie E，et al.Increased cardiac expression of endothelin-1 mRNA in ischemic heart failure in rats［J］.Cardiovasc Res，1997，33(3):601-610.

［3］Fiordaliso F，Chimenti S，Staszewsky L，et al.A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium from ischemiareperfusion injury［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(6):2046-2051.

［4］Li Y，Takemura G，Okada H，et al.Reduction of inflammatory cytokine expression and oxidative damage by erythropoietin in chronic heart failure［J］.Cardiovasc Res，2006，71(4):684-694.

［5］中華醫學會心血管病分會，中華心血管病雜志編輯委員會.慢性收縮性心力衰竭治療建議［J］.中華心血管病雜志，2002，30(1):7-23.

［6］Saito T，Hu F，Tayara L，et al.Inhibition of NOS2 prevents cardiac dysfunction in myocardial infarction and congestive heart failure［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283(1):339-345.

［7］Jones SP，Greer JJ，Van Haperen R，et al.Endothelial nitric oxide synthase over expression attenuates congestive heart failure in mice［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(8):4891-4896.