大鼠肝臟缺血再灌注損傷后水通道蛋白4表達的變化

燕少偉， 王立明， 張日新， 王海波

(1包頭醫學院第一附屬醫院，內蒙古 包頭 014010;2大連醫科大學附屬第二醫院，遼寧 大連 116000)

缺血再灌注損傷(ischemia－reperfusion injury，IRI)，是指發生缺血的組織器官，當恢復血液灌注后缺血性損傷進一步加重的現象。肝臟作為高灌注器官，非常容易發生IRI，IRI是造成肝移植術后移植肝臟原發失功、移植失敗及慢性排斥反應的主要原因之一，其發生率可高達88%［1］。因此，肝缺血再灌注損傷時的病理生理變化一直是國內外研究的重點。

水通道蛋白(aquaporins，AQP)是90年代新近發現的屬于細胞膜結構蛋白中的一個家族，擁有13(AQP0－12)個成員，可以提供液體快速跨生物膜轉運的通路，同時也參與甘油等小分子溶質的轉運［2，3］。AQP介導的水轉運具有速度快、不受膜脂質流動性及溫度的影響等特點，因此推測AQP可能參與體液容量調節，但其具體的生理作用還不十分清楚。雖然有許多學者對AQP家族已進行了一些研究，但多在生理條件下，對在病理條件下如肝臟發生缺血再灌注損傷時AQP變化的研究甚少。

AQP所有成員之間的基因序列具有一定的同源性。AQP4的基因定位在人染色體18q11.2與q12.1之間的連接處，由4個分別編碼127、55、27、92位氨基酸的外顯子組成，并被0.8、0.3和5.2 kb的內含子分隔開。AQP4的一級結構同其它AQP一樣，為跨細胞膜6次的單肽鏈，其氨基和羥基末端均位于細胞內，含3個胞外環(A、C、E)和2個胞內環(B、D)。AQP4整個分子前后兩部分在序列上相似，呈180°定位的正面對稱結構，內部結構與其它AQP同源性最高的是位于B環與E環上的冬酰氨－脯氨酸－丙氨酸(NPA)基序，NPA基序重疊位于脂質雙分子層之間，產生一個使水分子單線通過的通道，可使水分子順滲透壓梯度雙向轉運，這是AQP家族成員共有的特征性結構。AQP4的四級結構是由具有活性、分子量約34 kD亞單位組成的四聚體。四聚體在膜上的組裝是維持AQP的穩定和其正常功能所必須的。AQP4有3個mRNA亞型，由N端外顯子的差異所決定。它們分別是AQP41M1、AQP41M23和AQP41M23X。AQP41M1編碼的蛋白為M1，AQP41M23和 AQP41M23X編碼的蛋白為M23。M1比M23在N端多22個氨基酸。亞型的表達存在組織和年齡的差異。AQP4 C端第276－280位的5個氨基酸對于AQP4在細胞膜上的固定起著不可替代的作用，它們突變或缺失將導致AQP4不能固定于細胞膜上，影響生物學效應。已經有研究發現AQP4能夠維持膽管細胞頂膜區和基側膜區之間水通透性的平衡，其主要調控基側膜水的通透性，負擔15%水的轉運［4］，調節水在基底面和側面的擴散［4－6］。

肝臟IRI后常發生淤膽等多種膽道并發癥，可能與IRI后膽汁的分泌變化有關，但其分子機制目前尚不清楚。AQP4在肝臟內只表達于肝內膽管細胞，便于對其進行單獨研究。膽汁主要由肝細胞分泌，并由膽管內皮細胞和膽囊內膜細胞通過吸收和排泌改變其成分，其中包括維持滲透壓的溶質，如膽鹽和谷光苷肽，形成可能造成水的被動轉運的滲透壓梯度。在這一過程中，膽管細胞起著重要的作用，膽管細胞雖然只占肝臟細胞總數的3－5%，但產生的膽汁量約占總膽汁量的 40%，通過排泌 Na+、Cl－和HCO3－等離子，同樣形成滲透壓梯度。其功能改變可能導致一系列病理生理變化，如肝移植后膽道并發癥等。膽汁的生成與流動是靠膽鹽的主動排泌所導致的滲透壓梯度使水在AQP的易化作用下向膽管內移動而實現的［7］，因此AQP在肝臟膽汁分泌過程中起重要作用。而膽鹽通過肝腸循環重新回到肝臟，參與形成維持膽汁分泌的滲透壓梯度。

目前多項研究表明缺血再灌注損傷與水通道蛋白間存在密切關系［8，9］。本研究通過將大鼠肝蒂夾閉30 min后恢復血液灌注的方法建立肝缺血再灌注模型［10］，觀察一定時段AQP4在肝臟的表達變化情況，及在該病理條件下的表達變化與肝臟功能變化的關系，從新的角度探討肝缺血再灌注損傷的病理生理變化，并為其防治提供新的理論依據。

材料和方法

1 材料

1.1 動物及分組 選用48只健康6周齡雄性Wistar大鼠，體重(235±15)g，由大連醫科大學動物實驗中心提供。實驗動物按窩別和體重配成對子，隨機分配到缺血再灌注組及對照組2 h、1、3、7 d組，每小組6只。

1.2 主要試劑 多聚賴氨酸、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色液、Trizol均購于北京中杉金橋公司;RTPCR試劑盒6×buffer、上樣緩沖液、DNA marker均購于大連寶生物公司;AQP4抗體購于武漢博士德公司。主要試劑的配制:10×TBE電泳緩沖液:三羥甲基氨基甲烷［tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris］108 g，硼酸(boric acid)55 g，0.5 mol/L 乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)(pH8.0)40 mL，加三蒸水(ddd－H2O)溶解至 1000 mL，用時10倍稀釋。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS):NaCl 8.0 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4·H2O 1.56 g，KH2PO40.20 g，用 ddd－H2O 溶解并定容至1000 mL，調pH至7.2，高壓滅菌。二乙基焦磷酰胺(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理的 ddd－H2O:取1 mL DEPC加入999 mL ddd－H2O中，充分振蕩，常溫存放24 h后高壓蒸汽滅菌10 min，4℃保存備用。

2 方法

2.1 肝缺血再灌注損傷模型的建立 動物術前均自由進食、水。麻醉方法:實驗大鼠應用10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉。缺血再灌注組建立全肝缺血30 min再灌注損傷模型。大鼠麻醉成功后腹部備皮，取仰臥位，熱墊保持體溫在(36.5±0.5)℃，應用0.5%碘伏溶液常規消毒皮膚，鋪無菌孔巾，取腹部正中切口，上至劍突，下至恥骨上，逐層切開皮膚、腹白線及壁層腹膜，進入腹腔后小心游離肝門，用無損傷動脈夾夾閉肝蒂，阻斷出入肝臟血流(在此過程中濕鹽水紗布覆蓋切口，減少腹腔的不顯性失水)，30 min后重新恢復肝臟血液灌注。當松開動脈夾后肝臟在2－5 min內顏色由暗紅轉為鮮紅表明缺血再灌注損傷模型建立成功，關腹。若超過5 min肝臟顏色仍然未轉為鮮紅色則認為肝臟有血栓形成，排除出實驗。對照組將經過相同的手術操作，但僅不夾閉肝蒂，30 min后關腹。實驗大鼠麻醉清醒后自由進食、水，不給予抗生素。

2.2 標本采集 分別于再灌注2 h、1、3、7 d處死大鼠，留取標本。經腹主動脈取血6－8 mL靜置15 min后離心留取血清－26℃保存備用，以行間接膽紅素(indirect bilirubin，IB)、直接膽紅素(direct bilirubin，DB)及丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)檢測。取血后迅速以4℃的PBS液10 mL經門靜脈灌注至肝臟，摘除大鼠肝臟，每例標本平分為兩份，一份用10%PBS甲醛液固定以行病理及免疫組化檢測，另一份于液氮冷凍1 h后轉入－80℃保存以行反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT－PCR)檢測。每只大鼠相應檢測標本取材部位保持一致。

2.3 實驗指標的檢測 (1)血清IB、DB及ALT的檢測:用Olympus AU2000全自動生化分析儀檢測。(2)肝組織病理學檢測:經10%PBS甲醛溶液固定的肝組織標本行石蠟包埋，切片厚度為5 μm。經梯度乙醇脫水及二甲苯置換后行HE染色，觀察組織形態學變化。(3)AQP4的免疫組化檢測:肝臟蠟塊標本切片厚度為5 μm，經二甲苯脫蠟、梯度乙醇處理至水后，滴加0.3%過氧化氫室溫(溫度20℃，濕度80%)孵育10 min，以除去內源性過氧化物酶，PBS水洗3 min×3次;在0.1 mol/L枸櫞酸鈉液中高壓鍋(2 atm)抗原修復10 min，室溫自然冷卻后PBS洗3 min×3次;正常非免疫動物血清封閉10 min;滴加AQP4Ⅰ抗(兔抗鼠多克隆抗體，PBS稀釋 AQP41∶100)4℃孵育過夜，PBS洗3 min×3次;滴加生物素標記的Ⅱ抗(羊抗兔IgG抗體)室溫孵育15 min，PBS洗3 min×3次;滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化酶室溫孵育15 min，PBS洗3 min×3次后行DAB顯色1 min。在10×10倍光鏡下以每張切片胞膜上呈清晰黃褐色顆粒表達為陽性表達。隨機選取互不重疊的視野5個，10×40倍視野下對陽性表達區域，經圖像分析系統進行密度掃描，檢測每個視野內平均吸光度值，進行統計分析。(4)RT－PCR檢測肝組織AQP4 mRNA的表達:應用Trizol試劑常規一步法提取肝組織標本總RNA。以隨機引物逆轉錄合成cDNA:取2 μL RNA加入隨機引物1 μL 70℃水浴5 min，冰水驟冷，隨后加入5×PCR緩沖液4 μL，20 mmol/L dNTP 1 μL，RNasin 0.4 μL，蒸餾水3.4 μL，M － MLV 0.2 μL，總反應體積為 20 μL;反應條件:37℃ 60 min，90℃ 5 min。引物序列為:上游引物5'－GCATGAATCCAGCTCGATCCTTTGG －3'，下游引物5'－AATGGGTGGCAGGAAATCTGAGGC －3'，擴增片段長度407 bp。β－actin引物序列為:上游引物5’－ GATATCGCTGCGCTCGTCGTC －3'，下游引物5’－ CATGAGGTAGTCTGTCAGGTC －3’，擴增片段長度560 bp。PCR反應體系為:1 μL逆轉錄產物，10 ×PCR 緩沖液2 μL，20 mmol/L dNTP 1 μL，Taq 酶0.1 μL，引物1 μL，余量以蒸餾水補足體積至20 μL，PCR儀擴增。PCR反應條件:95℃ 1.5 min，55℃ 2 min，72℃ 1 min，40個循環，最后72℃ 8 min。反應產物10 μL加于1%瓊脂糖凝膠中電泳20 min，取出凝膠，紫外度值，以目標條帶灰度和β－actin灰度的比值進行統計分析。

3 統計學處理

配對樣本在透視分光儀下觀察結果并攝片，用β－actin校正半定量，凝膠圖像分析系統測定各電泳帶灰度值兩兩比較采用配對t檢驗。均采用 SPSS for Windows 12.0統計軟件進行數據統計分析，數據以均數±標準差()表示。

結 果

1 模型建立情況

所有實驗大鼠除2 h處死組外均于術后4 h內清醒，自由進食、水。所有實驗大鼠均無腹腔感染，無死亡發生。

2 肝功能檢測

各對照組間血清DB差異無顯著(P＞0.05)，缺血再灌注2 h、1 d、3 d組大鼠術后血清DB較對照組明顯升高(P＜0.05)，術后第1 d最高［(11.80±1.07)μmol/L缺血再灌注組 vs(5.01±0.53)μmol/L對照組］，P＜0.05，以后逐漸減少，于術后第7 d恢復正常［(5.53±0.41)μmol/L缺血再灌注組 vs(5.13±0.27)μmol/L對照組］。各對照組間血清IB差異無顯著(P＞0.05)，缺血再灌注2 h、1 d、3 d組大鼠術后血清IB較對照組明顯升高(P＜0.05)，術后第1 d最高［(20.71±1.46)μmol/L缺血再灌注組vs(7.62±0.98)μmol/L對照組］，以后逐漸減少，于術后第7 d恢復正常［(7.86±1.23)μmol/L缺血再灌注組 vs(6.53±0.87)μmol/L對照組］。各對照組間血清ALT差異無顯著(P＞0.05)，缺血再灌注2 h、1 d、3 d組大鼠術后血清ALT較對照組明顯升高(P＜0.05)，術后第1d最高［(55.75±3.31)U/L缺血再灌注組 vs(33.46±2.06)U/L對照組］，以后逐漸減少，于術后第 7d恢復正常［(22.32±1.16)U/L缺血再灌注組 vs(21.09±1.13)U/L對照組］，見圖1－3。

Figure 1.Comparison of serum DB level in rats 2 h，1 d，3 d and 7 d after hepatic ischemia－reperfusion injury..n=6.*P ＜0.05 vs sham －operation group.圖1 缺血再灌注組與對照組大鼠血清DB濃度比較

Figure 2.Comparison of serum IB level in rats 2 h，1 d，3 d and 7 d after hepatic ischemia－reperfusion injury..n=6.*P ＜0.05 vs sham －operation group.圖2 缺血再灌注組與對照組大鼠血IB濃度比較

3 肝臟病理學檢測

通過對肝臟組織切片HE染色觀察發現缺血再灌注組肝臟小葉中央靜脈周圍可見點片狀壞死區域，見圖4A、B。

4 免疫組化染色結果

在對照2 h、第1 d、第3 d、第7 d組均可見肝內膽管細胞AQP4表達陽性(A值分別為4033±316、4136±505、3929±328、3892±277)，各對照組間差異無顯著(P＞0.05);在 IRI各時相組，可見IRI后2 h、第1 d、第3 d AQP4表達均較對照組顯著下降(A值分別為2836±255、1279±107、2296±217)，與對照組比較均顯著差異(P＜0.05)，見圖5－9。其中以術后第1 d變化最顯著，以后AQP4的表達量逐漸增多，到術后第7 d時IRI組A值與對照組比較，差異無顯著(P＞0.05)，見圖10。

5 RT－PCR結果

對照組各時點AQP4 mRNA表達差異無顯著(P＞0.05)。在 IRI各時相組，可見在 IRI后2 h、1 d、3 d AQP4 mRNA表達較對照組顯著下降(P＜0.05)，IRI后第1 d組AQP4 mRNA表達下降最明顯，以后逐漸增加，IRI第7 d AQP4 mRNA表達恢復正常，見圖11、12。

Figure 3.Comparison of serum ALT activity in rats 2 h，1 d，3 d and 7 d after hepatic ischemia－reperfusion injury..n=6.*P ＜0.05 vs sham －operation group.圖3 缺血再灌注組與對照組大鼠血ALT活性比較

Figure 4.Pathological changes of rat liver tissues(HE staining，×100).A:ischemia － reperfusion 1 d group.Arrows indicate the degeneration and necrosis of cells.B:sham－operation group.圖4 缺血再灌注組和對照組大鼠肝組織HE染色切片

Figure 5.Immunohistochemical staining of AQP4 in rat liver section(×100)from sham －operation group.Cholangiocytes were stained as arrows indicated.圖5 對照組大鼠肝組織切片AQP4免疫組化染色蘇木精復染切片

Figure 6.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia－reperfusion 2 h group.Cholangiocyte staining(arrow －indicated)was obviously reduced.圖6 缺血再灌注2 h組AQP4免疫組化染色蘇木精復染切片

Figure 7.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia－reperfusion 1 d group.Arrow－indicated cholangiocyte staining was the weakest.圖7 缺血再灌注1 d組AQP4免疫組化染色蘇木精復染切片

Figure 8.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia－reperfusion 3 d group.Arrow －indicated cholangiocyte staining restored a little.圖8 缺血再灌注3 d組AQP4免疫組化染色蘇木精復染切片

Figure 9.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia－reperfusion 7 d group.Cholangiocyte staining obviously restored(arrow－indicated).圖9 缺血再灌注7 d組AQP4免疫組化染色蘇木精復染切片

Figure 10.Comparison of AQP4 expression in liver tissues examined using immunohistochemical staining in rats 2 h，1 d，3 d and 7 d after hepatic ischemia － reperfusion injury..n=6.*P＜0.05 vs sham－operation group.圖10 AQP4免疫組化染色強度比較

Figure 11.Comparison of AQP4 mRNA expression examined by RT － PCR in the liver of rats 2 h，1 d，3 d and 7 d after hepatic ischemia－reperfusion injury..n=6.*P ＜0.05 vs sham －operation group.圖11 AQP4 mRNA相對表達水平比較

Figure 12.Electrophoresis results of RT－PCR product of AQP4 mRNA in ischemia － reperfusion 2 h，1，3，7 d groups(A)and sham －operation group(B).圖12 缺血再灌注組和對照組AQP4 mRNA RT－PCR產物電泳結果

討 論

1 肝臟缺血再灌注模型問題

目前大鼠肝臟缺血再灌注模型建模方法較多，以夾閉肝蒂30 min和夾閉肝蒂及肝下下腔靜脈20 min的全肝缺血再灌注模型最為普遍，前者具有操作相對簡單及模型大鼠成活率高的優點。本實驗通過將模型大鼠肝蒂夾閉30 min后重新使其開放的方法建立肝臟缺血再灌注模型，在大體觀察上可見夾閉肝蒂后肝臟顏色明顯由鮮紅色轉為暗紅色，重新開放后又轉為鮮紅色;術后模型組大鼠出現血轉胺酶、膽紅素升高等肝功能受損表現;肝組織病理切片可見模型組大鼠肝細胞點片狀變性、壞死。這些變化與國內外關于缺血再灌注時肝臟的病理生理改變的報道相似，故本實驗復制的動物模型準確可靠。缺血再灌注組大鼠雖在夾閉肝蒂時同時夾閉了膽總管，但結扎膽總管8－24 h后方可造成膽紅素升高［11］，同時經預實驗證明單純結扎膽總管30 min與對照組比較，膽紅素變化無顯著差異(P＞0.05)，故本實驗中IRI組大鼠術后膽紅素升高不是由膽道阻斷所致。

2 AQP4在肝臟的定位表達與IRI

大鼠肝細胞(hepatocytes)主要表達AQP0、AQP8和 AQP9［12－14］，大鼠肝內膽管細胞(cholangiocytes)所表達的AQP種類是目前已知的所有細胞中最多的:AQP0、AQP1、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9和AQP11［15］，其中 AQP1和 AQP4 研究較為深入，包括分子、生化和功能研究。AQP4在肝臟主要存在于肝內膽管細胞基底面和側面，在這個區域有高表達。AQP4只表達于肝內膽管細胞而在肝細胞無表達，便于對其進行單獨研究。研究表明，鼠肝內膽管細胞AQP4過度表達導致對水的通透性升高。膽汁中98%為水，膽汁分泌與AQP密切相關［16］。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)可通過蛋白磷酸化的方式調節AQP4活性。PKC可在轉錄水平對AQP4 mRNA進行調節。pH值也是影響AQP家族表達的因素，尤其是當pH降到5.5以后，AQP4對乳酸鹽和水表現出特殊的通透性，其他如多巴胺、碳酸酐酶抑制劑及高水平的血小板源生長因子、成纖維細胞生長因子等也影響著AQP4的分布與表達。AQP4基因啟動子區域有一低氧誘導因子結合基序。低氧可下調AQP4 mRNA及蛋白的表達，重新給氧又可使AQP4水平恢復。溫度、激素、生長因子、視黃酸等因素的變化都會對水通道產生影響。本實驗通過免疫組化檢測方法發現肝內膽管可見棕黃色濃染，證明AQP4表達在肝內膽管細胞，這與國內外其它相關文獻報道相符。

肝臟是人體最大的消化腺，每天產生800－1000 mL膽汁，因此人們一直關注AQP在肝臟的分布、表達和功能。膽汁的生成與流動是靠膽鹽的主動排泌所造成的滲透壓梯度使水在AQP的易化作用下向膽管內移動實現的，而膽鹽通過肝腸循環重新回到肝臟，參與形成維持膽汁分泌的滲透壓梯度。AQP可以在存在滲透壓的情況下加速水的轉運，肝內膽管管腔和膽管上皮細胞基底的滲透壓差是持續存在的，發生肝內膽汁淤積時此滲透壓差可能會更高，此時水的通透量是決定膽汁生成量的主要因素，而水的通透量則取決于AQP的表達量及功能，本實驗證明當發生肝臟缺血再灌注損傷時，AQP4表達下降，可以解釋肝內膽管細胞水通透性降低及肝內膽汁淤積。當肝臟發生局部缺血時，缺血的肝組織進行無氧代謝使ATP生成減少，肝內膽管細胞中AQP4的數量和功能可能隨之改變，使水順滲透壓梯度向膽管內的轉運減少。而通過肝腸循環的膽鹽排泌保持較為恒定的數量(與腸道吸收的數量保持平衡)，造成肝小管內膽汁濃度過高，致使功能性淤膽。本實驗發現肝IRI后AQP4及AQP4 mRNA的表達量較對照組明顯減少，伴隨AQP4表達減少，大鼠血膽紅素迅速升高;隨著AQP4表達量的恢復，大鼠血膽紅素也漸趨正常，AQP4表達的減少可能是導致IRI后功能性淤膽的重要原因。

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