壓力負(fù)荷誘導(dǎo)大鼠心肌重塑早期左室舒張功能評(píng)價(jià)*

蓋迎利，徐 明，白 燕，肖 晗，馬曉偉，呂志珍，馮杰莉，張幼怡，李昭屏

(北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科，衛(wèi)生部心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

舒張性心力衰竭是嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病[1，2]，而高血壓是引起這一疾病的最常見病因[3]。深入研究舒張功能障礙的發(fā)生機(jī)制和尋找敏感而準(zhǔn)確的舒張功能評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)舒張性心力衰竭的早期診斷和治療至關(guān)重要。制備并準(zhǔn)確評(píng)價(jià)心肌肥厚及左室舒張功能異常動(dòng)物模型是探討舒張性心力衰竭發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。我們通過(guò)建立壓力負(fù)荷誘導(dǎo)大鼠心肌重塑模型，對(duì)其從心肌肥厚到舒張功能減退的全過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)而全面的評(píng)價(jià)，以探討大鼠心肌重塑早期左室舒張功能異常的評(píng)價(jià)方法。

材料和方法

1 壓力負(fù)荷誘導(dǎo)大鼠心肌重塑模型制備

選用3周齡SD雄性大鼠，體重45-55 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按照隨機(jī)原則將動(dòng)物分為4組:主動(dòng)脈縮窄3周組和6周組，主動(dòng)脈縮窄假手術(shù)3周組和6周組，每組各6只。采用橫向主動(dòng)脈縮窄(transverse aortic constriction，TAC)方法[4]建立壓力負(fù)荷心肌重塑模型，假手術(shù)組除不縮窄主動(dòng)脈外，其余步驟與手術(shù)組相同。

2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

術(shù)后每周對(duì)大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，連續(xù)、動(dòng)態(tài)觀測(cè)心臟結(jié)構(gòu)及功能的變化。采用Vevo770小動(dòng)物超聲儀，探頭頻率為17.5 MHz。大鼠吸入3%-4%異氟烷基礎(chǔ)麻醉[5]后，刮去胸前體毛，仰臥位固定于恒溫加熱板上，持續(xù)吸入1%-2%異氟烷，四肢與心電圖電極相連用于監(jiān)測(cè)心率并記錄心電圖，超聲心動(dòng)圖各參數(shù)連續(xù)測(cè)量5個(gè)心動(dòng)周期，計(jì)算均值。

2.1 左室結(jié)構(gòu)檢測(cè)及心肌重量評(píng)估 探頭置于大鼠胸骨前，二維超聲顯示左室短軸切面，于乳頭肌水平應(yīng)用M型超聲記錄左心室運(yùn)動(dòng)曲線，測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at enddiastole，LVIDd)和收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs)、舒張末期左室前壁厚度(left ventricular anterior wall thickness，LVAWd)和左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWd)，計(jì)算左心室重量{left ventricular mass，LVM=1.05 × [(LVIDd+LVPWd+IVSd)3-LVIDd3]×0.8}和左室短軸縮短率[left ventricular fractional shortening，F(xiàn)S%=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100%]。

2.2 二尖瓣血流頻譜測(cè)定 二維超聲清楚顯示心尖四腔心切面，取樣容積置于二尖瓣瓣尖水平，采用脈沖多普勒測(cè)定二尖瓣舒張?jiān)缙诜逯笛魉俣?E)和舒張晚期峰值血流速度(A)，計(jì)算E/A，測(cè)量E波減速時(shí)間(E-wave deceleration time，DT)，見圖1。

2.3 左室后壁心肌運(yùn)動(dòng)速度測(cè)定 參照文獻(xiàn)[6]方法顯示左室心尖長(zhǎng)軸切面組織多普勒速度模式，將取樣容積置于左室后壁乳頭肌水平，測(cè)定收縮期心肌運(yùn)動(dòng)速度(S')、舒張?jiān)缙谛募∵\(yùn)動(dòng)速度 (E')、舒張晚期心肌運(yùn)動(dòng)速度(A')，見圖2。

Figure2.Tissue Doppler imaging detected from left ventricular posterior papillary muscle level.E':early diastolic myocardial tissue velocities;A':late diastolic myocardial tissue velocities;S':systolic myocardial tissue velocities.圖2 乳頭肌水平左室后壁心肌組織多普勒頻譜

3 有創(chuàng)血液動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[7]方法，對(duì)TAC術(shù)后3周和6周大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)后行左室插管血液動(dòng)力學(xué)測(cè)定。采用2.0 F Millar導(dǎo)管經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈逆行插入左心室，穩(wěn)定后記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressur，LVEDP)、左心室壓力最大和最小上升速率(dp/dtmax和 dp/dtmin)，并計(jì)算 dp/dtmin/LVSP[8]。

4 心臟大體解剖參數(shù)測(cè)量

有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后處死大鼠，迅速取出心臟，稱量左心室重量(anatomy left ventricular mass，Anat LVM)，計(jì)算左心室重量/脛骨長(zhǎng)度(anatomy left ventricular mass/tibia length，Anat LVM/TB)。剪取部分左心室游離壁心肌行組織切片檢查。

5 心臟組織切片及染色

將所取左室游離壁心肌進(jìn)行天狼星紅染色，觀察心肌組織中膠原的變化。

6 心肌組織中羥脯氨酸含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]方法，利用羥脯氨酸(hydroxyproline)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物醫(yī)藥公司提供)，檢測(cè)每g濕重心肌組織中羥脯氨酸含量(μg)，即μg/g濕重。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果

1.1 超聲心動(dòng)圖左室結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果 小動(dòng)物超聲儀可清晰顯示大鼠心臟結(jié)構(gòu)，并能夠獲得滿意的M超左室運(yùn)動(dòng)曲線。TAC術(shù)后3周及6周LVAWd、LVPWd均明顯大于相應(yīng)假手術(shù)組(P＜0.01)，而LVIDd在同齡TAC組與假手術(shù)組間無(wú)顯著差異;由超聲心動(dòng)圖估算的Echo LVM/BW在TAC組也明顯大于假手術(shù)組(P＜0.01)，見表1。

表1 主動(dòng)脈縮窄組和假手術(shù)組大鼠超聲左室結(jié)構(gòu)參數(shù)比較Table1.Comparison of left ventricular structure between transverse aortic constriction group and sham-operated group by echocardiographic measurements(E.n=6)

表1 主動(dòng)脈縮窄組和假手術(shù)組大鼠超聲左室結(jié)構(gòu)參數(shù)比較Table1.Comparison of left ventricular structure between transverse aortic constriction group and sham-operated group by echocardiographic measurements(E.n=6)

LVAWd:left ventricular anterior wall thickness;LVPWd:left ventricular posterior wall thickness;LVIDd:left ventricular internal diameter at end-diastole;LVM/BW:left ventricular mass/body weight;HR:heart rate.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group.

Parameter LVAWd(mm) LVPWd(mm) LVIDd(mm) LVM/BW HR(min-1)3 weeks Sham 1.43±0.06 1.44±0.02 7.07±0.16 2.308±2440±0.10 307±20 TAC 1.71±0.11＊＊ 1.78±0.03＊＊ 7.45±0.13 3.51±0.20* 310±176 weeks Sham 1.65±0.07 1.72±0.03 7.60±0.18 2.39±0.20 305±31 TAC 2.21±0.17＊＊ 2.30 ±0.09＊＊ 7.68±0.28 4.02±0.10＊＊

1.2 超聲心動(dòng)圖左室功能結(jié)果 TAC術(shù)后3-6周，舒張?jiān)缙谧笫液蟊谛募∵\(yùn)動(dòng)速度E'顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01);二尖瓣E/A及DT在TAC組與假手術(shù)組間無(wú)顯著差異;FS在兩組間無(wú)顯著差異，見表2。

表2 主動(dòng)脈縮窄組和假手術(shù)組大鼠超聲左室功能指標(biāo)比較Table2.Comparison of left ventricular function between transverse aortic constriction group and sham-operated group by echocardiographic measurements(E.n=6)

表2 主動(dòng)脈縮窄組和假手術(shù)組大鼠超聲左室功能指標(biāo)比較Table2.Comparison of left ventricular function between transverse aortic constriction group and sham-operated group by echocardiographic measurements(E.n=6)

E/A:ratio of left ventricular peak E-wave velocity to atrial peak flow velocity;DT:mitral E-wave deceleration time;E':early diastolic myocardial tissue velocities;FS%:left ventricular fractional shortening.＊＊P ＜0.01 vs sham group.

Parameter E/A DT(ms) E'(mm/s) FS(%)3 weeks Sham 1.6±0.1 24.5±2.0 63.8±1.5 46.5±1.1 TAC 1.7±0.2 23.5±1.7 52.1±0.8＊＊ 46.1±1.16 weeks Sham 1.7±0.1 26.0±1.7 69.7±1.6 47.0±4.1 TAC 1.7±0.1 25.1±2.2 48.5±2.6＊＊44.1±2.6

2 有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)檢查結(jié)果

術(shù)后3周心導(dǎo)管檢測(cè)，TAC組大鼠LVSP顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，6周時(shí)進(jìn)一步增加(P＜0.01)。dp/dtmax、dp/dtmin、LVEDP 在 TAC 組和假手術(shù)組間無(wú)顯著差異;但經(jīng)LVSP校正后的左室舒張功能評(píng)價(jià)指標(biāo)dp/dtmin/LVSP在術(shù)后3周有下降的趨勢(shì)(48.9±5.9 vs 63.5±9.9);術(shù)后6周顯著下降(P＜0.05)，見表3。

3 心臟解剖稱重結(jié)果

TAC術(shù)后 3周和 6周時(shí)的 Anat LVM、Anat LVM/TB均顯著大于假手術(shù)組(P＜0.01)，見表4。主動(dòng)脈縮窄術(shù)后3周及6周大鼠Anat LVM和超聲心動(dòng)圖估算的左心室重量(echocardiographic left ventricular mass，Echo LVM)高度相關(guān)，r=0.90，P ＜0.01，見圖3。

表3 TAC組和假手術(shù)組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較Table3.Comparison of hemodynamic measurements between transverse aortic constriction group and sham-operated groups(E.n=5)

表3 TAC組和假手術(shù)組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較Table3.Comparison of hemodynamic measurements between transverse aortic constriction group and sham-operated groups(E.n=5)

LVSP:left ventricular systolic pressure;dp/dtmax:maximum rate of rise of left ventricular pressure;dp/dtmin:maximum rate of degression of left ventricular pressure;LVEDP:left ventricular end diastolic pressure;dp/dtmin/LVSP:corrected value of dp/dtminby LVSP.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group.

Parameter LVSP(mmHg) dp/dtmax(mmHg·s-1)dp/dtmin(mmHg·s-1) dp/dtmin/LVSP LVEDP(mmHg)3 weeks Sham 104.6±4.0 8404±556 6510±841 63.56.3±1.7±9.9 4.9±0.5 TAC 131.6±10.4* 8011±765 6501±520 48.9±5.9 3.5±1.76 weeks Sham 99.6±5.8 6438±699 5368±261 54.4±2.9 3.1±1.2 TAC 180.9 ±16.8＊＊ 7025 ±786 5913 ±676 35.4 ±4.0＊＊

Figure3.Correlation of left ventricular anatomic weight and ultrasound assessment mass.Anatomy LVM:anatomy left ventricular mass;Echo LVM:echocardiographic left ventricular mass.圖3 左心室解剖稱重和超聲評(píng)估相關(guān)性

表4 TAC組和假手術(shù)組大鼠左室重量與脛骨長(zhǎng)度之比Table4.The ratio of left ventricular mass to tibia length in TAC rats and sham-operated controls(E.n=6)

表4 TAC組和假手術(shù)組大鼠左室重量與脛骨長(zhǎng)度之比Table4.The ratio of left ventricular mass to tibia length in TAC rats and sham-operated controls(E.n=6)

LVM:left ventricular mass;TB:tibia length;LVM/TB:left ventricular mass/tibia length. ＊＊P ＜0.01 vs sham group.

Parameter LVM(mg) TB(mm) LVM/TB(mg·mm-1)3 weeks Sham 536±18 35.7±0.6 14.8±0.6 TAC 689 ±33＊＊ 34.2 ±0.8 19.6 ±1.1＊＊6weeks Sham 657±38 41.3±0.4 15.6±0.7 TAC 943±43＊＊ 40.5±0.7 23.2±0.9＊＊

4 組織形態(tài)學(xué)改變

顯微鏡下觀察，天狼星紅染色示心肌組織呈黃色，膠原呈紅色。術(shù)后3周TAC組可見血管周圍膠原沉積明顯增多，6周時(shí)膠原增加更顯著，且呈彌漫性改變，見圖4。

Figure4.Comparison of histomorphological changes in rat heart.A and C:3 and 6 weeks after sham operation;B and D:3 and 6 weeks after transverse aortic constriction.Increased collagen was seen in B and D(Sirius red staining，×200).圖4 心臟組織形態(tài)學(xué)變化比較

5 心肌組織中羥脯氨酸含量

TAC組3周左室心肌組織中羥脯氨酸含量與假手術(shù)組相比未見顯著變化[(382.1±19.3)μg vs(354.7±7.9)μg，P ＞0.05]，6周時(shí) TAC 組左室心肌中羥脯氨酸含量顯著高于假手術(shù)組[(465.3±17.3)μg vs(351.4 ±8.2)μg，P ＜0.05]，見圖5。

Figure5.The content of hydroxyproline in myocardial tissues.E.n=6.#P＜0.05 vs 3 weeks TAC group;*P＜0.05 vs sham group.圖5 左室心肌組織中羥脯氨酸含量

討 論

在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中，敏感而準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)動(dòng)物模型制作是否成功，并篩選出一致性好的模型，是確保實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌M(jìn)行和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠的重要基礎(chǔ)。我們利用高頻小動(dòng)物超聲儀連續(xù)觀測(cè)壓力負(fù)荷引起大鼠心肌重塑過(guò)程，顯示主動(dòng)脈縮窄術(shù)后3周大鼠左室前壁和左室后壁厚度均高于假手術(shù)組，而左心室舒張末內(nèi)徑在兩組無(wú)差異，提示手術(shù)組大鼠心肌出現(xiàn)了向心性肥厚，術(shù)后6周這種心肌肥厚繼續(xù)維持。由超聲心動(dòng)圖估測(cè)的左心室重量在手術(shù)組也明顯高于假手術(shù)組，且與解剖稱重的左室重量有良好的一致性(r=0.90，P＜0.01)，提示高頻小動(dòng)物超聲儀可以無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確、敏感地評(píng)價(jià)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠左心室肥厚。心肌組織中羥脯氨酸的含量可以反映膠原的蛋白表達(dá)水平，TAC術(shù)后組織病理顯示膠原含量增加以及心肌組織中羥脯氨酸含量增加均提示主動(dòng)脈縮窄組大鼠發(fā)生了心肌纖維化，這從組織形態(tài)學(xué)水平證實(shí)了壓力負(fù)荷大鼠發(fā)生了心肌重塑，驗(yàn)證了壓力負(fù)荷大鼠模型制作成功。

超聲心動(dòng)圖因其無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)性的特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床患者心功能的檢測(cè)，近年來(lái)也逐漸滲透到基礎(chǔ)研究中動(dòng)物模型的心功能評(píng)價(jià)。臨床上常用的左室收縮功能指標(biāo)是LVFS，左室舒張功能指標(biāo)是多普勒超聲心動(dòng)圖測(cè)得的二尖瓣舒張期血流頻譜E/A和E峰減速時(shí)間，但這些指標(biāo)反映的是心室前后負(fù)荷、心肌收縮力和心率等多種因素的綜合結(jié)果，并不適于心肌的收縮及舒張能力的評(píng)價(jià)。脈沖組織多普勒通過(guò)對(duì)局部心肌的實(shí)時(shí)速度追蹤，能夠定量地評(píng)價(jià)心肌運(yùn)動(dòng)，與有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)有良好的相關(guān)性，比傳統(tǒng)的舒張功能評(píng)價(jià)指標(biāo)(二尖瓣血流E/A)更能準(zhǔn)確而敏感地評(píng)價(jià)舒張功能[10-12]。但這一技術(shù)在小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用得還很少。由于小動(dòng)物心率較快，普通超聲心動(dòng)圖難以顯示清晰的二尖瓣血流頻譜和組織多普勒頻譜，故對(duì)其心臟舒張功能評(píng)價(jià)受到限制。目前尚無(wú)在清醒狀態(tài)下研究小動(dòng)物舒張功能的報(bào)道，即使經(jīng)過(guò)嚴(yán)格訓(xùn)練，能夠在清醒狀態(tài)下配合進(jìn)行超聲檢測(cè)的小鼠，也會(huì)由于心率較快，現(xiàn)有的超聲檢測(cè)技術(shù)無(wú)法區(qū)分舒張?jiān)缙诤褪鎻埻砥诘男募∵\(yùn)動(dòng)圖譜，只能看到心臟舒張期組織運(yùn)動(dòng)的融合波[13]。麻醉劑的應(yīng)用會(huì)影響到動(dòng)物的舒張功能，這主要是由于不同的麻醉方法和麻醉時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響動(dòng)物的心率，進(jìn)而影響心臟的舒張功能[13]，麻醉過(guò)深過(guò)久，導(dǎo)致心率嚴(yán)重減慢，會(huì)影響心功能檢測(cè)的準(zhǔn)確性。我們的研究采用異氟烷吸入1 min內(nèi)即能快速誘導(dǎo)麻醉，并利用Vevo770小動(dòng)物超聲儀高頻探頭(17.5 MHz)的特性，可以清晰地獲得二尖瓣舒張期早期和舒張晚期的血流頻譜及左室后壁心肌運(yùn)動(dòng)速度。檢測(cè)過(guò)程中可控給予維持濃度異氟烷吸入來(lái)平穩(wěn)地控制大鼠心率在270-330 bpm，超聲檢測(cè)在5 min之內(nèi)完成，大鼠在超聲檢測(cè)結(jié)束后1 min內(nèi)即可蘇醒，最大限度地減少了麻醉對(duì)心臟功能的影響。我們沒有進(jìn)一步研究不同心率狀態(tài)下心臟舒張功能的變化，但實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較心率無(wú)顯著差異，兩組具有可比性。我們的研究可以為小動(dòng)物舒張功能的評(píng)價(jià)及機(jī)制探討提供可靠幫助。

本研究中傳統(tǒng)的舒張功能評(píng)價(jià)指標(biāo)E/A和DT以及收縮功能指標(biāo)FS在術(shù)后3周和6周相應(yīng)TAC組和假手術(shù)組之間沒有顯著差異(P＞0.05)，而組織多普勒檢測(cè)的左室后壁心肌運(yùn)動(dòng)速度(E')在TAC組術(shù)后3周就出現(xiàn)明顯降低[(52.1±0.8)mm/s vs(63.8±1.5)mm/s，P ＜0.01]，提示主動(dòng)脈縮窄術(shù)后3周大鼠左室整體收縮和舒張功能尚正常的情況下，局部心肌已出現(xiàn)舒張功能障礙。這種心肌舒張功能減退同時(shí)被有創(chuàng)的血流動(dòng)力學(xué)檢查證實(shí):dp/dtmin為等容舒張期心室內(nèi)壓力下降最大速率，但其明顯受到主動(dòng)脈瓣關(guān)閉時(shí)心室內(nèi)壓力的影響，故用dp/dtmin/LVSP來(lái)校正以更準(zhǔn)確地反映心肌舒張功能[8]，dp/dtmin/LVSP在TAC組術(shù)后3周就有下降趨勢(shì)，術(shù)后6周進(jìn)一步降低，與假手術(shù)組相比有顯著差異。

綜上所述，超聲心動(dòng)圖的組織多普勒技術(shù)可以準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)而敏感地評(píng)價(jià)主動(dòng)脈縮窄法壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠心肌重塑模型早期左室舒張功能的改變，心肌肥厚和心肌組織纖維化是心肌舒張功能減退的病理基礎(chǔ)。

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