CREG調控IGF2R/IGFII內吞抑制人血管平滑肌細胞增殖*

閆承慧，欒 波，黃明方，李 杰，張效林， 韓雅玲△

(1沈陽軍區總醫院全軍心血管病研究所心內科，遼寧 沈陽 110840;2南京軍區福州總醫院心內科，福建 福州 210002)

冠心病等心血管病嚴重危害人類健康，隨著我國人民生活水平的提高和生活方式的改變，心血管疾病發病正不斷增加，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是其主要病理基礎[1]。AS的病理變化包括脂質聚集、單核－巨噬細胞的侵入、泡沫細胞形成、炎癥及血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增生等。闡明VSMCs在病理性刺激中的增殖機制，對減緩AS的進程，預防和治療AS的發生發展可能起到積極的作用。

人E1A激活基因阻遏子(human cellular repressor of E1A －stimulated gene 1，hCREG)基因是1998年Veal等[2]從HeLa細胞中克隆的一個新的細胞分化調控基因。CREG蛋白過表達可以抑制體外培養的畸胎瘤細胞增殖并促進其分化[3]。進一步研究證實[4，5]，hCREG 是一種分泌型糖蛋白，可與胰島素樣生長因子II(insulin－like growth factor II，IGFII)競爭性結合細胞膜胰島素樣生長因子Ⅱ受體(insulinlike growth factor II receptor，IGF2R)，以自分泌和旁分泌2種途徑調控細胞分化。本室前期研究發現，hCREG蛋白過表達能抑制體外培養的人VSMCs的增殖并促進其向分化表型轉化[6，7]。同時在體頸動脈損傷模型研究也發現，CREG基因過表達可以抑制損傷誘導的大鼠VSMCs由分化表型向合成表型的轉化，同時抑制新生內膜的形成和再狹窄的發生[8，9]。但 hCREG 抑制人 VSMCs增殖的作用機制仍有待闡明。本研究旨在應用本室構建的CREG正、反義逆轉錄病毒載體pLNCX2－CREG和pSM2－siCREG，感染體外培養的人VSMCs，通過G418和嘌呤霉素抗性篩選建立過表達hCREG和hCREG沉默的人 VSMCs株，觀察 CREG表達增強或沉默對VSMCs增殖的效應，并深入闡明其調控機制。

材料和方法

1 材料

人VSMCs由本室保存。pLNCX2－CREG質粒由Han等[10]構建。pSM2－siCREG質粒購自 Open Biosystems。抗 CREG和 CD31單克隆抗體購自R＆D、抗平滑肌α－actin、平滑肌MHC和PCNA多克隆抗體購自北京中杉金橋公司。Ⅱ抗為辣根過氧化物酶標記的抗小鼠、抗山羊和抗大鼠的IgG購自北京中杉金橋公司。ECL化學發光試劑盒購自Sigma。Alexa 488熒光探針購自Cell Signalling Technology。PD98059和LY294002購自Sigma。

2 方法

2.1 逆轉錄病毒制備、滴度測定及細胞系感染 感染前1 d將Phoenix 293包裝細胞系接種于35 mm皿上，使細胞在感染當天達到70% －80%的融合率。采用磷酸鈣沉淀法進行逆轉錄病毒轉染及病毒制備。采用流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白在293細胞中的表達以確定病毒滴度。將1.5×106VSMCs接種于直徑35 mm平皿，細胞生長到90% －95%融合時，按照逆轉錄病毒感染方案將含有LNCX2－CREG和SM2－siCREG的逆轉錄病毒分別感染VSMCs，感染24 h后傳代，傳代第2 d加入G418600 mg/g和puromycin 1 mg/g篩選7－10 d，用克隆環挑取生長良好的耐藥克隆，培養、擴增后鑒定并凍存備用。

2.2 陽性細胞克隆中CREG表達檢測 將G418和puromycin陽性克隆分別進行擴增，在無血清培養條件下培養24 h，用TCA法收集培養基中蛋白;在有血清培養條件下，細胞生長至90% －95%融合時收獲并裂解細胞，收集細胞總蛋白。Western blotting檢測培養上清及細胞中CREG表達。

2.3 細胞增殖能力檢測

①流式細胞術檢測細胞周期 將細胞無血清培養48 h后，換成有血清的培養液培養48 h。胰蛋白酶消化細胞，PBS洗2次，75%乙醇固定過夜。PBS再洗3次，吸盡殘余的PBS，用PI染料染1 h，過膜去除細胞凝集塊后，應用流式細胞儀進行檢測。

②BrdU摻入實驗 于6孔板中每孔接種1×104個細胞，每組細胞平行做2個復孔。37℃、5%CO2中培養48 h后換液，加入10 g/L BrdU，繼續培養2 h后，常規固定、通透，濃鹽酸變性5 min，封閉后加anti－BrdU抗體(1∶100)4℃過夜，Ⅱ抗 (1∶100)室溫2 h，加入DAB，待顯色明顯時PBS終止反應，并以蘇木素復染細胞核。顯微鏡下觀察細胞核著色情況。每孔計數10個視野，計算著色細胞比例。

2.4 細胞膜蛋白提取 收集貼壁生長至80%的VSMCs、VSMCs－CREG 和 VSMCs－siCREG 細胞，用總蛋白和膜蛋白提取試劑盒分別提取細胞的總蛋白和胞膜蛋白，BCA方法定量后行Western blotting檢測。Ⅰ抗分別為抗IGF2R抗體和抗β－actin抗體。

2.5 共聚焦顯微鏡觀察IGF2R的細胞定位 用抗IGF2R抗體標記VSMCs、VSMCs－CREG和VSMCssiCREG。用FITC或者TRITC標記的Ⅱ抗進行免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡下觀察IGF2R在細胞內的定位。

2.6 ELISA法檢測 IGFII分泌 用 ELISA檢測VSMCs、VSMCs－CREG 和 VSMCs－siCREG 培養上清IGFII含量。3組細胞在60 mm培養皿中融合至80%左右，棄去培養基，無菌PBS洗滌，5 mL×3次，將殘留液體吸盡，加無血清的DMEM 4 mL(以盡量少的液體覆蓋細胞表面)，置37℃、5%CO2細胞培養箱繼續培養24 h后收集上清，進行ELISA檢測。實驗前以細胞計數結果校對上樣量，并且使上樣量保持一致，按ELISA試劑盒說明書進行。酶標儀讀取結果，每次實驗讀數取2個，重復3次。

2.7 RT－PCR檢測 Trizol試劑提取細胞的總RNA，核酸蛋白測定儀測定RNA濃度及純度，RNA純度為260/280，比值 1.7 －1.9，加入去 RNase 水調整濃度至1 g/L。用逆轉錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA第1鏈，RT－PCR引物擴增目標片段。IGFII因子的擴增引物:上游引物 5'－CTTGGACTTTGAGTCAAATTGG－3'，下游引物5'－GGTCGTGCCAATTACAT －3'，擴增片段長度292 bp，β－actin作為內參照。

2.8 Western blotting檢測 按文獻[9]采用 BCA比色法測定裂解液中總蛋白質的濃度并調蛋白的濃度至1 g/L，樣品經120 g/L分離膠進行SDS－PAGE。每個泳道上樣30 μL，在4℃的循環水浴內以300 mA電流將樣品轉至硝酸纖維素濾膜上，時間為2 h。滴加含50 g/L脫脂奶粉的TBS－T緩沖液室溫封閉1 h，以TBS－T洗膜3次，每次10 min。依次滴加1∶1000的Ⅰ抗(4℃孵育過夜，TBS－T洗膜3次，每次10 min)及4 μL 1∶2000 HRP 標記的Ⅱ抗(室溫孵育2 h，洗膜同前述)。用ECL化學發光顯色，Kodak黑白膠片成像。

2.9 Alexa 488－IGFII細胞內吞實驗 用Alexa 488熒光探針標記重組的IGFII，GE柱子純化去除未標記熒光分子。將VSMCs培養于24孔細胞培養板中，細胞密度為20%－30%。將標記好的熒光分子定量加入到細胞培養上清中，冰上孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察細胞內吞情況。

2.10 阻斷實驗 IGF2R中和抗體、重組IGF2R蛋白和PI3K/Akt信號抑制劑LY294002、ERK信號通路抑制劑PD98059分別添加到細胞培養上清中，流式細胞術檢測其對細胞增殖的作用。

3 統計學處理

采用SPSS 11.5統計軟件包進行分析，數據以均數±標準差()表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。

結 果

1 CREG基因過表達抑制體外培養的VSMCs增殖

CREG基因過表達組VSMCs增殖能力較正常對照組明顯受到抑制，G1期細胞比例增多，G2/S期細胞數目顯著減少。CREG基因沉默(siCREG)組的VSMCs增殖能力明顯增強，細胞周期顯著縮短，見圖1。

2 CREG調控IGF2R受體在細胞膜上的表達干預IGFII內吞

與正常對照組細胞相比較，盡管CREG基因過表達細胞總蛋白中IGF2R表達未見明顯增加，但細胞膜上IGF2R表達及分布均顯著增加。CREG基因沉默細胞中IGF2R總蛋白的表達明顯增加，但大部分表達集中在細胞漿內，而膜上IGF2R蛋白的表達及分布明顯下降，見圖2。這提示CREG基因的表達變化干擾了IGF2R的表達及在細胞膜上的分布。

與對照組細胞相比較，CREG過表達組細胞上清中IGFII的分泌減少，而CREG基因沉默組細胞上清中IGFII的分泌顯著增加，見圖3A。3組細胞中IGFII在RNA水平無明顯變化，見圖3B。CREG過表達組IGFII的內吞顯著，而CREG基因沉默組細胞未能檢測到IGFII的內吞發生，見圖3C。上述研究證實:CREG基因表達變化改變了細胞膜受體IGF2R的表達及分布，干擾了其對細胞因子IGFII內吞的調控，引起CREG沉默細胞中IGFII分泌增加。

Figure1.Up－regulation of CREG inhibited vascular smooth muscle cell proliferation.A:CREG expression detected by Western blotting;B:Cell proliferation detected by BrdU assay;C:Cell cycle determined by flow cytometry..n=6.*P＜0.05 vs control.圖1 CREG過表達抑制血管平滑肌細胞增殖

Figure2.CREG regulated the expression and localization of IGF2R in cellular membrane.A:Western blotting showed the expression of IGF2R in cellular membrane and cell lysate;B:immunofluorescence showed that the localization of IGF2R in the cells.圖2 CREG調控細胞膜受體IGF2R的表達與定位

3 中和抗體干預IGF2R/IGFII表達對VSMCs增殖的影響

正常對照組細胞或CREG過表達組細胞，應用中和抗體阻斷了IGF2R的作用，引起G2/S期細胞比例呈濃度依賴性增加。應用重組IGF2R小肽阻斷了IGFII的內吞作用后，所得到結果與中和抗體結果一致，見圖4。這提示CREG通過介導IGF2R/IGFII內吞作用抑制VSMCs增殖。

4 IGFII活化PI3K/Akt/ERK信號通路介導CREG沉默誘導的VSMCs增殖

CREG沉默組細胞中PI3K/Akt和MAPK－ERK均較正常組和過表達CREG組明顯活化，見圖5。應用PD98059和LY294002分別抑制上述2種信號的活化后，結果發現上述2種抑制劑均部分抑制了CREG基因沉默誘導的細胞增殖現象，見圖5。

討 論

hCREG是一種可以阻遏12S E1A介導的腺病毒E2和熱休克蛋白70轉錄激活的分泌型糖蛋白[2]，參與維持正常組織細胞的成熟和分化。我室的前期研究發現，與合成表型(增殖型)的VSMCs相比較，分化表型(非增殖型)的VSMCs中CREG的表達明顯增加[6]。并且CREG過表達抑制了體外培養的VSMCs增殖，對抗了血管損傷引起的VSMCs增殖和血管狹窄的發生[8－10]。這些研究提示，CREG 可能具有抑制VSMCs增殖和誘導細胞分化的生物學功能，從而維持VSMCs處于靜息成熟狀態。VSMCs增殖能力是生物體內成熟的VSMCs由分化表型向去分化表型發生轉化的重要特征之一，也是多種血管疾病發生發展的重要病理基礎。因而，深入闡明CREG對抗VSMCs增殖的分子機制將可能對心血管疾病防治研究提供重要的理論依據和候選基因。

Figure3.CREG regulated the secretion and endocytosis of IGFII in vitro.A:ELISA detected the effect of CREG expression on the secretion of IGFII in VSMCs;B:RT－PCR analysis showed the expression of CREG in transcriptional level in VSMCs;C:internalization of labeled IGFII detected with Alexa 488..n=6.＊＊P＜0.01 vs control.圖3 過表達CREG基因抑制IGFII的分泌，促進IGFII的內吞

Figure4.Inhibiting the endocytosis of IGF2R to IGFII promoted the proliferation of VSMCs.A:the endocytosis was inhibited by neutralized antibody of IGF2R(anti－IGF2R)or recombinant human IGF2R(rhIGF2R).B:the percentages of the cells at G1－phase decreased as the increased concentration of rhIGF2R or anti－IGF2R..n=6.*P＜0.05 vs control(0).圖4 抵制IGF2R對IGFII的內吞可促進VSMCs的增殖

Figure5.PI3K/Akt and MAPK/ERK pathways were involved in CREG －regulated cellular proliferation.A:the protein expression of p－Akt，PI3K and p－ERK was detected by Western blotting.B:LY294002(LY)and PD98059(PD)，inhibitors of PI3K/Akt pathway and MAPK/ERK pathway，respectively，were used to determined the roles of the two pathways..n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control.圖5 PI3K/Akt和MAPK/ERK信號轉導通路參與CREG對細胞增殖的調控

在前期研究工作的基礎上，本研究應用逆轉錄病毒載體感染和抗性藥物的篩選，分別獲得了能夠穩定傳代的hCREG高表達細胞株(VSMCs－CREG)和hCREG表達抑制的細胞株(VSMCs－siCREG)。并通過Western blotting分析證實了VSMCs－CREG細胞中hCREG表達較對照細胞增加;而VSMCs－si-CREG細胞中hCREG表達較對照細胞降低。這2株細胞系的建立為進一步研究hCREG對VSMCs增殖的作用機制提供了較好的細胞學研究平臺。

本室先前研究證實[11，12]，CREG 蛋白可能與膜受體蛋白IGF2R存在相互作用。為明確CREG基因表達對VSMCs增殖的作用機制，本研究首先應用膜蛋白提取和免疫熒光染色等方法分析了CREG基因表達對細胞膜受體蛋白IGF2R的表達分布的影響，證實了CREG基因過表達可以促進IGF2R在細胞膜上的分布;僅而通過熒光示蹤標記方法確定IGF2R受體在細胞膜上大量分布加速了生長因子IGFII的內吞作用。相反，當 CREG基因表達被抑制后，VSMCs細胞膜上受體IGF2R蛋白分布顯著下降，同時IGFII因子的內吞受到抑制。為進一步明確IGFII因子內吞與CREG介導的細胞增殖的關系，我們進行了IGF2R中和抗體的阻斷研究以及重組IGF2R小肽的干預研究，證實IGFII因子的內吞作用受到抑制后，可明顯加速 VSMCs的增殖。PI3K/Akt和MAPK/ERK兩個經典的細胞增殖調控信號通路協同參與了IGFII對VSMCs增殖的調控作用。

總之，這些研究工作從分子水平闡明CREG基因過表達促進IGF2R－IGFII內吞，抑制VSMCs細胞增殖的作用機制。同時也證實IGFII啟動的VSMCs增殖是PI3K/Akt和MAPK/ERK信號轉導通路協同作用介導的，僅單獨應用一種增殖信號通路的抑制劑難以有效抑制VSMCs的增殖現象。因而，只有充分了解細胞增殖的機制，找到誘導細胞增殖的“關節點”蛋白，才能更有效地進行細胞學和在體的干預治療研究。

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