環(huán)孢菌素A對大鼠腹主動脈球囊損傷后內(nèi)膜增生的抑制作用*

熊龍根，黎德恩，董 頎

(1廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260;2廣州醫(yī)學(xué)院生理教研室，廣東 廣州 510182)

冠狀動脈內(nèi)支架置入術(shù)是冠心病介入治療的一個重大進展，可通過抑制血管的彈性回縮，預(yù)防晚期血管重塑，使經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)后再狹窄率降低20% －30%[1]。但支架術(shù)必然會引起內(nèi)膜損傷導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。炎癥細胞所釋放的各種生長因子和細胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增生、基質(zhì)分泌，VSMCs向內(nèi)膜遷移，使內(nèi)膜過度增生，內(nèi)膜增厚，導(dǎo)致再狹窄的發(fā)生，因此，VSMCs遷移及增殖是目前再狹窄形成的關(guān)鍵。

研究表明，鈣(Ca2+)/鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)－鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)－活化T細胞核因子(nuclear factors of activated T －cells，NFATc)信號系統(tǒng)在VSMCs遷移及增殖中起作用[2]，該信號系統(tǒng)可能參與支架術(shù)后再狹窄的形成。以往研究報道多以離體培養(yǎng)的VSMCs作為觀察對象，發(fā)現(xiàn)抑制該通路可減少細胞的分化增殖[2，3]。但在球囊損傷后再狹窄動物模型中是否有作用，目前還未見報道。本實驗擬通過觀察CaN特異性抑制劑環(huán)孢菌素A對大鼠腹主動脈球囊損傷后內(nèi)膜增殖的影響，為再狹窄的防治提供新的思路。

材料和方法

1 動物模型的建立與分組

將36只體重350－450 g、10－12周的雄性 SD大鼠(購自廣東省實驗動物監(jiān)測所)隨機分為假手術(shù)組(n=12)、球囊損傷組(n=12)和環(huán)孢菌素治療組(n=12)。參照石永英等[4]的方法制作大鼠腹主動脈損傷模型，用3%戊巴比妥鈉溶液按50 mg/kg腹腔注射麻醉。球囊損傷組和環(huán)孢菌素治療組大鼠仰臥固定手術(shù)臺上，沿頸前正中線切開皮膚，在頸前三角區(qū)暴露左頸總動脈，結(jié)扎左頸總動脈遠心端，沿頸總動脈斜行剪開一小切口，在導(dǎo)絲指引下將20 mm×1.5 mm PTCA球囊導(dǎo)管(購自雅培公司)從切口送至腹主動脈末端，以6ATM的壓力充盈球囊擴張30 s，抽至負壓后，間歇60 s，再次送入球囊，重復(fù)以上操作，共3次。結(jié)扎近心端的左頸總動脈，切斷兩結(jié)扎端之間的動脈，適量慶大霉素局部噴灑手術(shù)野，縫合切口。假手術(shù)組除不插入球囊導(dǎo)管外，其余操作同手術(shù)組。術(shù)中全身肝素化(100 U/kg)，術(shù)后每天慶大霉素1.5 mg/kg腹腔注射以預(yù)防感染，共3 d。術(shù)中球囊損傷組6只死亡，環(huán)孢菌素治療組5只死亡，假手術(shù)組2只死亡。術(shù)后普通飼料喂養(yǎng)，飲水不限。通過常規(guī)病理學(xué)檢測血管管腔面積、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜厚度/中膜厚度等，并與假手術(shù)組相比較，以此判斷模型是否成功。

2 常規(guī)病理檢查

各組大鼠均于術(shù)后30 d處死。用3%戊巴比妥鈉溶液按50 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后切開大鼠腹腔取損傷血管段。血管置于4%多聚甲醛中固定24 h后，脫水、透明、石蠟包埋和切片。切片厚度為5 μm，每隔100 μm取一張切片，進行HE染色。采用光學(xué)顯微鏡和Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對各組HE染色切片進行圖像分析。首先進行圖像編輯，用鼠標準確地勾出外彈力膜、內(nèi)彈力膜以及管腔輪廓，測量外彈力膜、內(nèi)彈力膜以及管腔的輪廓的周長，再根據(jù)公式周長=2πr，算出各個截面的半徑，逐步測算血管新生內(nèi)膜厚度、中膜厚度。其中，內(nèi)膜厚度=(內(nèi)彈力膜周徑－管腔周徑)/2π，中膜厚度=(外彈力膜周徑－內(nèi)彈力膜周徑)/2π。每張切片測3次。

3 免疫組化染色

石蠟切片(5 μm)后，用SP法(SP試劑盒購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司)進行CaN(Ⅰ抗稀釋度1∶150，CaN抗體購自Abcam)的免疫組化染色。細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)黃色或棕褐色處為陽性信號。利用Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，測定平均吸光度值以表示陽性產(chǎn)物的強度，平均值越大，其陽性反應(yīng)產(chǎn)物表達強度越強，表明蛋白的含量越高。

4 熒光定量PCR實驗

RNA提取按Trizol試劑(購自Invitrogen)說明書進行，于EP管加入1 mL Trizol試劑，用眼科剪將血管迅速剪切3 min，剪碎后充分勻漿至組織完全裂解。再經(jīng)氯仿、異丙醇提取總RNA。核酸蛋白定量儀測定mRNA的A260/A280，確定其純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自TaKaRa)要求的標準進行。熒光定量PCR中的引物，其中NFATc3由TaKaRa合成，CaN、β－actin的引物由Invitrogen合成。熒光定量PCR反應(yīng)根據(jù)熒光定量PCR試劑盒(購自TaKa-Ra)說明書在ABI7500進行，反應(yīng)條件如下:a.預(yù)變性:95℃ 30 s。b.PCR反應(yīng):95℃ 5 s;60℃ 34 s。c.融解曲線分析:95℃ 15 s;60℃ 60 s;95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后確認real－time PCR的擴增曲線和融解曲線，記錄各管的 Ct值。公式:ΔΔCt=(Ct目的基因－Ct管家基因)實驗組－ (Ct目的基因－ Ct管家基因)對照組，計算相對表達量，本實驗以假手術(shù)組為對照組，其余各組mRNA的相對表達量用對照組的2－ΔΔCt倍表示。CaN、NFATc3和β－actin的引物序列見表1。

表1 β－actin、CaN和NFATc3 mRNA的引物序列Table1.The primers for β － actin，CaN and NFATc3 mRNA

5 統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，采用單因素方差分析(ANOVA)并作樣本均數(shù)兩兩比較的Turkey檢驗。

結(jié) 果

1 病理形態(tài)學(xué)

HE染色鏡下觀察與圖像分析:假手術(shù)組內(nèi)膜由一層完整而連續(xù)的內(nèi)皮細胞構(gòu)成，各層結(jié)構(gòu)正常、清晰，無明顯VSMCs增殖和遷移，內(nèi)膜無增厚。球囊損傷組顯示管腔面積縮小，內(nèi)腔面變得粗糙，中層VSMCs大量增殖，并且向內(nèi)膜下遷移，可見內(nèi)彈力板斷裂，有顯著新生內(nèi)膜形成，厚度不均，胞外基質(zhì)增加，無內(nèi)皮細胞，內(nèi)彈力板附近有大量梭形核的VSMCs，排列紊亂，局部平滑肌縱向排列，呈向內(nèi)膜方向生長的趨勢。環(huán)孢菌素治療組管腔面積較單純模型組有所擴大，內(nèi)膜下僅見輕微的新生內(nèi)膜，見圖1。球囊損傷組、環(huán)孢菌素治療組內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜厚度/中膜厚度顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，而環(huán)孢菌素治療組內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜厚度/中膜厚度顯著低于球囊損傷組 (P ＜0.05)，見表2。

表2 各組動物內(nèi)膜增生情況Table2.Intimal hyperplasia of rat abdominal aorta in all groups(μm.)

表2 各組動物內(nèi)膜增生情況Table2.Intimal hyperplasia of rat abdominal aorta in all groups(μm.)

*P ＜0.05 vs sham group;△P ＜0.05 vs balloon － injured group.I/M:intimal thickness/medial thickness.

Group n Intimal thickness Medial thickness I/M Sham 10 10.004±2.163 311.497±53.460 0.033±0.006 Balloon－injured 6 202.275±66.175* 382.310±60.455 0.519±0.103*Cyclosporine A7 70.700±21.021＊△360.065±97.774 0.200±0.062＊△treatment

Figure1.Histology of intima of abdominal aorta in rats(HE staining，×200).A:sham group;B:balloon－injured group;C:cyclosporine A treatment group.圖1 大鼠腹主動脈內(nèi)膜組織學(xué)檢測

2 各組免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

假手術(shù)組血管壁CaN幾乎不表達。球囊損傷組血管中膜和內(nèi)膜VSMCs細胞CaN表達量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，大部分細胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色或棕褐色顆粒。環(huán)孢菌素組中膜和內(nèi)膜VSMCs細胞表達低于球囊損傷組，見圖2。環(huán)孢菌素組與假手術(shù)組CaN的平均光密度值顯著低于球囊損傷組(P＜0.05)，見表 3。

3 各組血管壁CaN和NFATc3 mRNA表達量的比較

經(jīng)球囊損傷后，球囊損傷組血管組織CaN及其下游NFATc3表達顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，而環(huán)孢菌素組CaN、NFATc3表達明顯低于球囊損傷組(P＜0.05)，但較假手術(shù)組有所增加，見表4。

Figure2.CaN expression in intima of rat abdominal aorta(HE staining，×400).A:sham group;B:balloon－injured group;C:cyclosporine A treatment group.圖2 大鼠腹主動脈內(nèi)膜CaN表達

表3 各組免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果Table3.The results of immunohistochemistry in each group()

表3 各組免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果Table3.The results of immunohistochemistry in each group()

*P ＜0.05 vs sham group;△P ＜0.05 vs balloon － injured group.

Group n Average absorbance Sham 10 0.00712 ±0.00229 Balloon － injured 6 0.06892 ±0.01856*Cyclosporine A treatment 7 0.01610 ±0.00220△

表4 各組CaN和NFATc3 mRNA相對表達量Table4.The relative expression of CaN and NFATc3 mRNA in each group()

表4 各組CaN和NFATc3 mRNA相對表達量Table4.The relative expression of CaN and NFATc3 mRNA in each group()

*P ＜0.05 vs sham group;△P ＜0.05 vs balloon － injured group.

Group n CaN mRNA NFATc3 mRNA Sham 10 1.110 ±0.608 1.063 ±0.365 Balloon －injured 6 2.143 ±0.831* 2.076 ±0.698*Cyclosporine A treatment 7 1.146 ±0.336△ 1.071 ±0.436△

討 論

CaN屬絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員(又稱蛋白磷酸酶2B，PP2B)，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca2+/鈣調(diào)素(CaM)調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶。CaN是由結(jié)合CaM的催化亞基(CnA)和結(jié)合Ca2+調(diào)節(jié)亞基(CnB)按1∶1的比例緊密結(jié)合而組成的異源二聚體。1979年CaN首先在牛腦內(nèi)被分離純化，其廣泛分布于全身各組織細胞中，其中在神經(jīng)組織及T淋巴細胞中含量特別豐富，在心臟及骨骼肌中較高表達，血管組織中亦存在CaN分布，提示CaN可能對VSMCs存在重要的生理作用?；罨疶細胞核因子(NFAT)是由 NFATc1、(NFAT2/c)、NFATc2(NFAT1/p)、NFATc3(NFAT4/x)、NFATc4(NFAT3)及 NFAT5等5個成員構(gòu)成的核轉(zhuǎn)錄因子。NFAT是一類與眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相聯(lián)系，具有廣泛生理功能的轉(zhuǎn)錄因子，其主要是通過受體－Ca2+－CaN信號途徑被激活，NFAT被激活后則從胞漿轉(zhuǎn)入胞核，從而發(fā)揮其基因調(diào)控功能。NFAT的激活與VSMCs增殖與遷移有關(guān)[2，5，6]。環(huán)孢菌素 A 是 CaN 的特異性抑制劑，與胞內(nèi)相應(yīng)的免疫親和蛋白質(zhì)結(jié)合，使得與CnB結(jié)合的螺旋狀區(qū)域向免疫親和蛋白質(zhì)一方有所偏移，從而提高了免疫親和蛋白質(zhì)－抑制劑復(fù)合物結(jié)合CaN的能力，以抑制CaN的酶活力。CaN可通過其去磷酸化作用調(diào)節(jié)Ca2+通道、影響胞內(nèi)Ca2+濃度、參與VSMCs增殖等功能活動的調(diào)控，其特異性底物NFAT激活后可以傳遞細胞外信號而引起VSMCs核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，刺激 VSMCs增殖[7－9]。PDGF － BB 是VSMCs的促有絲分裂劑，Jabr等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PDGF－BB是通過Ca2+/CaM－CaN－NFATc信號系統(tǒng)介導(dǎo)VSMCs增生。Nilsson等[11]研究發(fā)現(xiàn)ET－1孵育VSMCs，用免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)VSMCs內(nèi)NFATc3有明顯的核易位，若用NFAT抑制劑A－285222和EF－1共同孵育VSMCs，則NFATc3核易位明顯受抑制，從而抑制VSMCs增殖。雷尼丁是鈣激動劑，楊永健等[12]發(fā)現(xiàn)在雷尼丁刺激的大鼠VSMCs增殖中，雷尼丁可使VSMCs中CaN活性增強，同時使VSMCs蛋白核酸合成率增加，環(huán)孢菌素A可明顯抑制該作用，表明CaN信號通路在雷尼丁刺激的VSMCs增殖中發(fā)揮重要作用。本實驗顯示，環(huán)孢菌素A可使大鼠腹主動脈損傷后內(nèi)膜增生減輕，減少再狹窄的發(fā)生。為了探討環(huán)孢菌素A是否通過抑制CaN信號通路，從而減輕大鼠腹主動脈球囊損傷后內(nèi)膜的增殖作用，本研究用免疫組織化學(xué)檢測各組血管壁CaN的表達，同時用熒光定量PCR方法檢測各組大鼠血管壁中CaN、NFATc3 mRNA的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素A可以使損傷血管壁CaN蛋白、CaN mRNA和NFATc3 mRNA的表達顯著減少。

本研究結(jié)果表明，Ca2+/CaM－CaN－NFATc信號系統(tǒng)參與了VSMCs的增殖與遷移，而環(huán)孢菌素可以抑制CaN信號通路，從而減輕大鼠腹主動脈損傷后的VSMCs的增殖，增加損傷后的管腔面積，抑制內(nèi)膜增生。環(huán)孢菌素的這種作用可用于血管損傷后再狹窄的預(yù)防，為臨床防止再狹窄提供實驗依據(jù)。除CaN抑制劑(CsA、FK506)外，其下游NFATc可成為阻止再狹窄的作用新位點，如 VIVIT可抑制NFATc從而可減輕內(nèi)膜VSMCs增殖及新生內(nèi)膜形成，其優(yōu)點是可提供特異性的抑制藥物，避免免疫抑制等并發(fā)癥發(fā)生?？傊?，Ca2+/CaM－CaN－NFATc信號通路在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)后再狹窄中的作用的闡明，以及對CaN作用機制的深入研究，對進一步認識經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)后再狹窄具有重要意義，為臨床經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)后再狹窄的防治新措施提供了一條新的思路。

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