Ephrin－A3在脂多糖處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖中的表達(dá)*

王繼先，張博愛，劉 宇，何 昕，李 林，張 勤

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生困難，其機(jī)制尚不完全明確，藥物應(yīng)用及康復(fù)訓(xùn)練等只能改善而不能完全恢復(fù)其原有功能，給社會、家庭及個(gè)人造成沉重負(fù)擔(dān)，因此研究損傷后細(xì)胞反應(yīng)及分子變化非常重要。研究表明Eph/ephrin在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，不僅參與神經(jīng)系統(tǒng)早期的形態(tài)發(fā)生、發(fā)展及功能塑造，還參與調(diào)節(jié)成年期突觸可塑性以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后反應(yīng)[1]。星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AS)約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總數(shù)的90%，它不僅僅是一種營養(yǎng)支持細(xì)胞，還在突觸形成及功能的控制、成體神經(jīng)發(fā)育、信息交流、腦血流的調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)[2]、檢測神經(jīng)元活力和釋放化學(xué)遞質(zhì)調(diào)控神經(jīng)元[3]等方面起重要作用，多年來的研究顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等與炎癥有密切關(guān)系，而炎癥反應(yīng)可以激活A(yù)S。該實(shí)驗(yàn)通過脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)大鼠大腦皮層AS建立炎癥模型，觀察ephrin－A3在AS增殖中的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中的分子機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone。胎牛血清杭州四季青公司。多聚賴氨酸、兔抗GFAP多克隆抗體購自Sigma。Ephrin－A3多克隆抗體(Santa Cruz)，吖啶橙(acridine orange，AO)∕嗅化乙啶(ethidium bromide，EB)熒光試劑盒、MTT試劑盒及CY3熒光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。抗腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF － α)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、白細(xì)胞介素6(interleukin，IL－6)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自武漢博士德生物制品公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 動物 SPF級健康新生(24 h內(nèi))Wistar大鼠，雌雄不限，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

2 方法

2.1 原代大鼠AS的培養(yǎng)、純化和鑒定 取新生24 h內(nèi)的 Wistar大鼠，參照 McCarthy等[4]報(bào)道的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)純化。使用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)鑒定所培養(yǎng)的 AS，取第3代AS(純度＞97%)用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為6組:空白對照組，LPS 10 mg/L作用30 min組、6 h組、24 h組、48 h組和72 h組。

2.3 AS形態(tài)學(xué)觀察 應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察AS的生長情況及形態(tài)變化。

2.4 MTT法測定AS存活率 使用96孔培養(yǎng)板，每孔接種1×104細(xì)胞，置37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，加入LPS 100 μL(10 mg/L)，每組復(fù)孔8 個(gè)(n=8)，分別孵育30 min、6 h、24 h、48 h 和72 h 后，每孔加入 10 μL MTT 溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL formanzan溶化液，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育直至在顯微鏡下觀察，F(xiàn)ormazan結(jié)晶全部溶解。以空白孔調(diào)零，使用酶標(biāo)儀測定570 nm波長的吸光度值(A值)。使用等量不加LPS的無血清DMEM作為對照組。

2.5 AO/EB檢測AS凋亡率 各組AS培養(yǎng)至不同時(shí)點(diǎn)后應(yīng)用AO/EB熒光試劑盒行AO/EB染色，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。熒光顯微鏡下觀察，可見4種細(xì)胞形態(tài):活細(xì)胞，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu);早期凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)著綠色并呈固縮狀或圓珠狀;晚期凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀;非凋亡的死亡細(xì)胞，核染色質(zhì)著紅色并呈正常結(jié)構(gòu)。高倍鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野分類計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=(早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞)∕(活細(xì)胞+非凋亡的死亡細(xì)胞+早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞)×100%。

2.6 ephrin－A3和GFAP表達(dá)的免疫熒光測定 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)至不同時(shí)點(diǎn)后以4%多聚甲醛固定，應(yīng)用ephrin－A3和GFAPⅠ抗及CY3熒光試劑盒(Ⅱ抗)行染色，測定不同時(shí)點(diǎn) ephrin－A3和GFAP的表達(dá)，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。含5%牛血清白蛋白(bovine serun albumin，BSA)的TBS Tx(g/L，Tris堿 2.42，NaCl 8，Triton X －1001，pH 7.6)，封閉60 min;各組分別加ephrin－A3抗體和GFAP抗體濃度為1∶100，4℃過夜;CY3標(biāo)記的抗兔IgG濃度為1∶200，作用60 min;抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈紅色熒光。應(yīng)用Image－Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件分析各實(shí)驗(yàn)組的熒光圖片單個(gè)細(xì)胞的累積A值及平均累積A值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.7 ELISA法測定炎癥因子 各組AS培養(yǎng)至不同時(shí)點(diǎn)后應(yīng)用ELISA法檢測TNF－α和IL－6的含量，每組樣本6個(gè)。分別用TNF－α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒和IL－6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定，操作按說明書進(jìn)行，用Bioelisa Reader ELx800測定A值，測定波長為450 nm，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品擬合曲線計(jì)算出具體含量，結(jié)果以pg/L表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AS形態(tài)觀察及鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察，提取的細(xì)胞在種植1 h后開始貼壁，6 h后大部分細(xì)胞可貼壁，呈橢圓形、梭形及不規(guī)則形，24 h后所有細(xì)胞均貼壁，光暈明顯，并可見少數(shù)細(xì)胞伸出1－2個(gè)細(xì)微的突起，3 d后細(xì)胞數(shù)量開始增加，胞體明顯增大，突起數(shù)量增多，長度增加，并可見部分突起出現(xiàn)分支。傳至第3代時(shí)用抗GFAP抗體進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果顯示AS純度可達(dá)97%以上，見圖1A，并檢測AS上是否有ephrin－A3的表達(dá)，見圖1B。

Figure1.Immunochemical staining of astrocytes.A:GFAP －positive astrocytes(×200);B:ephrin－A3－positive astrocytes(×400).圖1 AS免疫組化染色

2 MTT法測定AS活性

LPS(10 mg/L)作用 AS 6 h、24 h、48 h 和72 h 的細(xì)胞活性均提高，與對照組相比均有顯著差異(P＜0.05)，而30 min組細(xì)胞活性與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。30 min組、48 h組和72 h組的細(xì)胞活性與24 h組相比均有顯著差異(P＜0.05)，見表1。

表1 10 mg/L LPS作用不同時(shí)點(diǎn)的AS吸光度值及凋亡率比較Table1.The A570value and apoptotic rate(%)of the astrocytes in 10mg/L LPS for different times()

表1 10 mg/L LPS作用不同時(shí)點(diǎn)的AS吸光度值及凋亡率比較Table1.The A570value and apoptotic rate(%)of the astrocytes in 10mg/L LPS for different times()

△P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs 24 h group.

Group A570(n=8) Apoptotic rate(n=4)Control 0.07 ±0.03* 18.89 ±1.40*30 min 0.07 ±0.02* 18.87 ±1.11*6 h 0.12 ±0.05△＊ 16.04 ±5.32△＊24 h 0.16 ±0.06△ 14.12 ±2.87△48 h 0.11 ±0.03△＊ 15.86 ±1.52△＊72 h 0.11 ±0.04△＊ 17.11 ±1.35△＊

3 AO/EB檢測AS凋亡率

LPS(10 mg/L)作用AS 6 h、24 h、48 h 和72 h 的細(xì)胞凋亡率均下降，與對照組相比均有顯著差異(P＜0.05)，而30 min組細(xì)胞凋亡率與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。30 min組、48 h組和72 h組的細(xì)胞凋亡率與24 h組相比均有顯著差異(P＜0.05)，見表1、圖2。

4 ephrin－A3和GFAP表達(dá)的免疫熒光測定結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各組AS的胞體和突起均呈紅色熒光，細(xì)胞核不顯色，為一暗區(qū)。LPS作用24 h、48 h和72 h的胞體和突起的 ephrin－A3和GFAP的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，并有逐漸增強(qiáng)趨勢，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，而30 min組和6 h組與對照組相比變化不大(P＞0.05)，各組與24 h組相比，差異顯著(P ＜0.05)，見表2、圖3、4。

5 IL－6及TNF－α含量測定

LPS作用6 h內(nèi)，IL－6和TNF－α含量維持在低水平，稍有增加(P＞0.05)，24 h時(shí)增加明顯。與對照組相比，脂多糖作用24 h、48 h和72 h時(shí)IL－6和TNF－α含量顯著升高(P＜0.05)，與24 h相比差異顯著(P＜0.05)，見表3。

表2 各組AS不同時(shí)點(diǎn)ephrin－A3和GFAP的CY3熒光染色I(xiàn)ATable2.The IA of ephrin－A3 in astrocytes of different time point(.n=5)

表2 各組AS不同時(shí)點(diǎn)ephrin－A3和GFAP的CY3熒光染色I(xiàn)ATable2.The IA of ephrin－A3 in astrocytes of different time point(.n=5)

△P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs 24 h group.

Group ephrin－A3 GFAP Control 0.386 ±0.003* 0.419 ±0.010*30 min 0.388 ±0.004* 0.421 ±0.020*6 h 0.393 ±0.003* 0.424 ±0.010*24 h 0.439 ±0.006△ 0.507 ±0.030△48 h 0.468 ±0.004△＊ 0.540 ±0.020△＊72 h 0.507 ±0.006△＊ 0.675 ±0.040△＊

表3 各組培養(yǎng)液中IL－6和TNF－α含量比較Table3.Changes of IL－6 and TNF－α in culture medium of every group(.n=6)

表3 各組培養(yǎng)液中IL－6和TNF－α含量比較Table3.Changes of IL－6 and TNF－α in culture medium of every group(.n=6)

△P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs 24 h group.

Group IL－6(pg/L) TNF－α(pg/L)Control 249.1 ±20.1* 70.3 ±9.1*30 min 251.2 ±19.7* 70.8 ±6.9*6 h 278.9 ±28.5* 71.5 ±8.3*24 h 2057.8 ±47.6△ 79.1 ±7.6△48 h 2374.6 ±38.5△＊ 98.5 ±7.4△＊72 h 2486.3 ±35.7△＊ 101.7 ±6.5△＊

Figure2.AO/EB fluorescein staining of AS in every group(×200).A:control group;B:30min group;C:6h group;D:24 h group;E:48 h group;F:72 h group.圖2 各組AS不同時(shí)點(diǎn)AO/EB熒光染色

討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后無法恢復(fù)原有功能的主要原因是軸突再生障礙，是由多因素共同作用的結(jié)果，包括缺乏軸突生長和導(dǎo)向的生長促進(jìn)因子、細(xì)胞微環(huán)境的抑制性改變以及軸突導(dǎo)向分子的參與等。

以往研究表明EphA4廣泛分布于大腦神經(jīng)元上，特別是海馬錐體神經(jīng)元的樹突棘上，在應(yīng)答中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的分子機(jī)制中表達(dá)上調(diào)，且起負(fù)向調(diào)控作用[5]。而ephrin－A3是EphA4的關(guān)鍵配體，定位于AS環(huán)繞樹突棘部分的ephrin－A3對維持和活化樹突棘的正常形態(tài)起著重要作用，其與樹突棘結(jié)合后激活EphA4，而EphA4的活化可以縮短樹突棘的長度和降低樹突棘的密度，從而起到負(fù)向調(diào)控作用[6]。所以本實(shí)驗(yàn)選擇ephrin－A3作為一個(gè)切入點(diǎn)研究。

Figure3.Fluorescein staining of ephrin－A3 with CY3 in AS of every group(×200).A:control group;B:30 min group;C:6 h group;D:24 h group;E:48 h group;F:72 h group.圖3 各組AS不同時(shí)點(diǎn)ephrin－A3 CY3熒光染色

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或發(fā)生神經(jīng)退行性疾病后，炎癥反應(yīng)非常明顯，AS被激活，產(chǎn)生一系列炎癥因子、趨化因子和營養(yǎng)因子等，在神經(jīng)元的發(fā)育和存活、軸突的再生、神經(jīng)干細(xì)胞的分化等過程中發(fā)揮重要作用。LPS是最常用最經(jīng)典的致炎劑，多被用來制作神經(jīng)細(xì)胞的炎癥損傷模型[7]。本實(shí)驗(yàn)通過LPS誘導(dǎo)AS建立炎癥模型，檢測培養(yǎng)液中炎癥因子變化，發(fā)現(xiàn)AS培養(yǎng)液內(nèi)IL－6和TNF－α顯著增加、AS凋亡減少、存活增加及特異性蛋白GFAP表達(dá)增加，說明LPS在一定時(shí)間內(nèi)可以促進(jìn)AS分泌炎癥因子，促進(jìn)AS活化增殖。實(shí)驗(yàn)表明LPS可以激活炎癥通路促進(jìn) AS分泌 IL－6、IL－8、TNF－α、一氧化氮(nitric oxide，NO)、炎癥因子 10(inflammatory factor 10，IP10)、活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)等炎癥因子[7]，并促進(jìn)AS活化增殖[8]。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相符，都表明炎癥因子在AS增殖中起重要作用。

Figure4.Fluorescein staining of GFAP with CY3 in AS of every group(×200).A:control group;B:30 min group;C:6h group;D:24 h group;E:48 h group;F:72 h group.圖4 各組AS不同時(shí)點(diǎn)GFAP CY3熒光染色

Eph受體酪氨酸家族及其配體ephrins是一種軸突導(dǎo)向分子家族，其在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中通常低水平表達(dá)，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)損傷如AS、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞活化時(shí)出現(xiàn)上調(diào)，表達(dá)上調(diào)直接抑制軸突再生，另外，Eph表達(dá)也可以調(diào)控AS增生和膠質(zhì)疤痕形成[9]，還有研究表明Eph可通過調(diào)控AS骨架蛋白重組從而調(diào)控其反應(yīng)性[10]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)測定ephrin－A3，發(fā)現(xiàn)其隨著GFAP增加有上調(diào)趨勢，說明其可能與細(xì)胞增殖有關(guān)，綜合上述實(shí)驗(yàn)表明Eph家族可能在AS增殖中發(fā)揮重要作用。

損傷后炎癥反應(yīng)可能改變Ephs和ephrins表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn):白細(xì)胞抑制因子(LIF)和IFN－γ可上調(diào)AS EphA4蛋白表達(dá)，體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)EphA4基因敲除的AS對炎癥因子如LIF或IFN－γ無反應(yīng)，而海馬損傷后，反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞(IFN－γ)受體mRNA表達(dá)上調(diào)的同時(shí)膠質(zhì)ephrin－B1表達(dá)也升高[11]，在多發(fā)性硬化 (multiple sclerosis，MS)疾病中，當(dāng)急性炎癥脫髓鞘發(fā)生時(shí)AS Eph/ephrin在損傷活化處表達(dá)上調(diào)，而在慢性脫髓鞘非活化處炎癥因子信號下降或消失，這一現(xiàn)象支持炎癥因子與Ephs及ephrins表達(dá)上調(diào)有關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)ephrin－A3表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，AS培養(yǎng)液內(nèi)的IL－6和TNF－α增加，說明兩者之間存在一定關(guān)系，但其中誰是起始因素不能確定。

細(xì)胞因子信號也是調(diào)控膠質(zhì)增殖的關(guān)鍵因素，它可引起AS EphA4表達(dá)增加，而后Rho激酶通路激活，而LIF不能引起EphA4基因敲除AS反應(yīng)性增殖則表明LIF介導(dǎo)的膠質(zhì)活化可能需通過EphA4受體信號途徑起作用。實(shí)驗(yàn)表明Rho激酶信號可促進(jìn)AS增殖[13]，Eph－Rho通路可能是星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的起始物。本實(shí)驗(yàn)初步觀察到ephrin－A3表達(dá)變化與AS增殖及炎癥因子之間存在聯(lián)系，但炎癥反應(yīng)、Eph/ephrin家族表達(dá)變化和AS反應(yīng)性是否有直接關(guān)系尚不完全清楚，需要進(jìn)一步深入研究。

體外實(shí)驗(yàn)表明ephrins在各種細(xì)胞軸突再生中起抑制作用，如ephrin－A5－Fc可抑制EphA4受體陽性的大鼠胚胎腹側(cè)脊髓神經(jīng)元軸突發(fā)生，ephrin－A5作用于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和ephrin－B3作用于皮層神經(jīng)元均可抑制軸突發(fā)生[14]。半定量法測定ephrins mRNA在傳入神經(jīng)阻滯的海馬中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)多種ephrins mRNA表達(dá)上調(diào)包括ephrin－A3，有研究顯示在MS中的反應(yīng)性AS中ephrin－A3上調(diào)[12]。這些說明ephrin－A3可能參與成年腦中樞神經(jīng)損傷后的再生及可塑性調(diào)節(jié)，且在其中可能起負(fù)向調(diào)控作用。所以，Eph/ephrin信號可能不止通過一種機(jī)制抑制軸突再生，它在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的結(jié)果中起關(guān)鍵作用。

綜上可知，無論是ephrin－A3表達(dá)上調(diào)、AS增殖還是炎癥反應(yīng)，其最終的結(jié)果都可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中起負(fù)向作用，另外，研究已經(jīng)證實(shí)，ephrinB/EphB信號系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)樹突棘形態(tài)發(fā)生和可塑性，在含有失活EphB2體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，樹突棘無法成熟，其逆向傳導(dǎo)對樹突棘形成也很重要[15]。可見ephrin/Eph在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中占據(jù)了重要地位。通過對ephrin/Eph的調(diào)控，可能對腦卒中等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的治療和康復(fù)產(chǎn)生重要影響。

[1]Pasquale EB.Eph－ephrin bidirectional signaling in phys-iology and diease[J].Cell，2008，133(1):38 －52.

[2]Seth P，Koul N.Astrocyte，the star avatar:redefined[J].J Biosci，2008，33(3):405 －421.

[3]Fellin T.Communication between neurons and astrocyte:relevance to the modulation of synaptic and network activity[J].J Neurochem，2009，108(3):533 －544.

[4]McCarthy KD，Vellis JD.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue[J].J Cell Biol，1980，85(3):890 －902.

[5]趙燕玲，張博愛，賈延劼，等.EphA4在海人酸誘導(dǎo)大鼠大腦皮層神經(jīng)元凋亡中的表達(dá)及天麻素的影響[J].中國病理生理雜志，2009，25(10):1917－1921.

[6]Carmona MA，Murai KK，Wang L，et al.Glial ephrin － A3 regulates hippocampal dendritic spine morphology and glutamate transport[J].Proc Natl Acad Sci，2009，106(30):12524－12529.

[6]Yeh SH，Hung JJ，Gean PW，et al.Hypoxia－inducible factor－1α protects cultured cortical neurons from lipopolysaccharide－induced cell death via regulation of NR1 expression[J].Neurosci，2008，28(52):14259 －14270.

[8]熊家巷，白 云，宋 敏，等.炎性介質(zhì)脂多糖、γ干擾素活化星形膠質(zhì)細(xì)胞效應(yīng)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30(22):2065－2068.

[9]Goldshmit Y，McLenachan S，Turnley A.Roles of Eph receptors and ephrins in the normal and damaged adult CNS[J].Brain Res Rev，2006，52(2):327 －345.

[10]Puschmann TB，Turnley AM.Eph receptor tyrosine kinases regulate astrocyte cytoskeletal rearrangement and focal adhesion formation[J].J Neurochem，2010，113(4):881－894.

[11]Wang Y，Zhou CF.Involvement of interferon－γ and its receptor in the activation of astrocytes in the mouse hippocampus following entorhinal deafferentation[J].Glia，2005，50(1):56－65.

[12]Sobel RA.Ephrin A receptors and ligands in lesions and normal－ appearing white matter in multiple sclerosis[J].Brain Pathol，2005，15(1):35 －45.

[13]Nicole O，Goldshmidt A，Hamill CE，et al.Activation of protease－activated receptor－1 triggers astrogliosis after brain injury[J].J Neurosci，2005，25(17):4319 －4329.

[14]Kullander K，Croll SD，Zimmer M，et al.Ephrin－B3 is the midline barrier that prevents corticospinal tract axons from recrossing，allowing for unilateral motor control[J].Genes Dev，2001，15(7):877－888.

[15]Segura I，Essmann CL，Weinges S，et al.AGrb4 and GIT1 transduce ephrinB reverse signals modulating spine morphogenesis and synapse formation[J].Nat Neurosci，2007，10(3):301－310.