蛋白酶體抑制劑MG132對腦室室管膜下區神經干細胞增殖潛能的影響*

趙云鶴，張衛國，朱 茜，楊桂姣，陸 利

(山西醫科大學人體解剖學教研室，山西 太原 030001)

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)是中樞神經系統的原始細胞，具有自我更新和多向分化潛能[1]。NSCs不僅存在于發育中的中樞神經系統，而且還富集于成年哺乳動物側腦室室管膜下區(subventricular zone，SVZ)、海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)、嗅球等腦區[2]。有報道證實，隨年齡增加，體內NSCs增殖能力下降、數量減少，而且這種由于機體內環境失衡所致的干細胞庫耗竭是多種老年性疾病的共同病因[3]，其潛在的機制亟待闡明。蛋白酶體是新近受到關注的蛋白水解酶復合體，它通過選擇性降解泛素化的靶蛋白參與維持內環境穩態，介導細胞多種生命活動過程。有關蛋白酶體功能活性與NSCs增殖能力的相關研究尚未見報道。為此，本研究擬應用蛋白酶體抑制劑MG132注射入成年小鼠側腦室，通過5－溴－2'－脫氧尿嘧啶核苷(5－bromo－2'－deoxyuridine，BrdU)摻入實驗動態觀察蛋白酶體活性改變對NSCs增殖能力的影響，為神經退行性疾病發病機制研究提供新思路。

材料和方法

1 材料

清潔級BALB/c小鼠，由山西醫科大學實驗動物中心提供。蛋白酶體抑制劑MG132購自碧云天生物技術研究所，蛋白酶體活性檢測試劑盒為Millipore產品，BrdU購自Sigma，山羊血清封閉液購自博士德生物工程有限公司，BrdUⅠ抗購自Millipore，山羊抗鼠CY3熒光Ⅱ抗購自Sigma，DAPI熒光封片劑為Vector產品。

2 方法

2.1 動物分組 選擇90日齡、體重(20±2)g、清潔級BALB/c小鼠60只，雌雄各半，隨機分為6組(實驗組3 d、7 d、14 d 組和對照組3 d、7 d、14 d 組)，每組10只。實驗組側腦室注射蛋白酶體抑制劑MG132(10 g/L，DMSO稀釋)，對照組注射等體積DMSO。側腦室注射3 d、7 d、14 d后每組5只小鼠提取SVZ總蛋白，檢測蛋白酶體活性;另5只小鼠進行BrdU腹腔注射標記NSCs，免疫熒光染色，檢測SVZ BrdU+NSCs數量。

2.2 蛋白酶體抑制劑MG132側腦室定位注射 小鼠以3%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于江灣I型腦立體定位儀，手術區備皮、消毒，正中線切開皮膚，暴露前囟，參照小鼠腦立體定位圖譜[4]于前囟前0.67 mm，左側旁開0.6 mm，垂直進針，進針深度2.2 mm。將 1 μL MG132(10 g/L)，緩慢注入側腦室，注射完畢留針5 min再緩慢退出，縫合頭皮，術后保溫飼養。另設DMSO溶劑對照組，左側側腦室注射 1 μL DMSO。

2.3 蛋白酶體活性檢測 提取SVZ總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將30 μg總蛋白加入蛋白酶體活性檢測反應體系，37℃孵育2 h，SPECTRAMax－M2e熒光酶標儀380 nm(激發光)/460 nm(發射光)處測定熒光強度。計算實驗組和對照組熒光強度比值，統計學軟件進行數據分析。

2.4 BrdU腹腔注射標記NSCs 配制BrdU(6 g/L)溶液，按30 mg/kg給予小鼠腹腔注射，每隔2 h注射1次，共注射6次。于末次注射24 h后灌注取材，Leica恒冷箱切片機進行連續冠狀切片，片厚16 μm，收集兩側胼胝體連接起始處至前連合連接部位(前囟+1.10 mm至前囟+0.14 mm)的所有腦片。

2.5 免疫熒光染色 腦片丙酮浸沒，2 mol/L HCl 37℃水浴孵育17 min打開DNA雙鏈;BrdUⅠ抗4℃孵育過夜;熒光Ⅱ抗37℃孵育2 h;DAPI封片液封片，Olympus熒光顯微鏡下觀察、攝片，計數各組胼胝體連接起始處至前連合連接部位所有腦片SVZ BrdU+NSCs數量，統計學軟件進行數據分析。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差()表示，多組間的比較采用One－way ANOVA方差分析，兩組間比較采用t檢驗。

結 果

1 BrdU免疫熒光染色

BrdU腹腔注射24 h，免疫熒光染色可見BrdU+NSCs分布于側腦室SVZ，陽性細胞密集排列于側腦室背外側區，見圖1A－a。BrdU+著色部位為細胞核，形態為圓形或橢圓形，可與細胞核特異性熒光染料DAPI，見圖1A－b;重疊呈現粉紅色，見圖1A－c。MG132注射側和對側BrdU+NSCs數量無顯著差別(P ＞0.05)，見圖1B。

Figure1.Immunofluorescent staining of BrdU in SVZ.A:the distribution of BrdU+cells around the lateral ventricle，bar=100 μm(a)，bar=25 μm(b，c);B:quantification of the number of BrdU+cells.圖1 腦室室管膜下區BrdU免疫熒光染色

2 MG132注射后不同時點SVZ蛋白酶體活性

側腦室注射MG1323 d、7 d、14 d后提取SVZ總蛋白，熒光酶標儀檢測蛋白酶體活性，見圖2。結果顯示MG132注射3 d、7 d組SVZ蛋白酶體活性較DMSO對照組顯著降低，分別降至0.662±0.100(P＜0.05)和0.687±0.105(P＜0.05)，提示側腦室注射MG132短時程內(3 d、7 d)能夠有效抑制SVZ蛋白酶體活性。MG132注射14 d后SVZ蛋白酶體活性較3 d、7 d顯著增高(P＜0.05)，與DMSO對照組相比無明顯差異(P＞0.05)，提示可逆性蛋白酶體抑制劑MG132側腦室注射14 d后其抑制作用消失，SVZ蛋白酶體活性恢復至正常水平。

Figure2.Fold of proteasome activity after injection of MG132 or DMSO.*P ＜ 0.05 vs DMSO in the same time point;△P ＜0.05 vs 14 d.圖2 MG132組和DMSO組注射后不同時點蛋白酶體活性變化

3 MG132注射后不同時點SVZ BrdU+細胞數

側腦室注射MG1323 d、7 d后，SVZ BrdU+NSCs降至21±4(圖3D')和22±3(圖3E)，較 DMSO 對照組[67±8(圖3A)和53±6(圖3B)]明顯減少(圖4)，P＜0.05，提示降低SVZ蛋白酶體活性能夠顯著抑制NSCs增殖能力。側腦室注射MG13214d后隨SVZ蛋白酶體活性恢復BrdU+NSCs數量升至82±4(圖3F)，與DMSO對照組相比(67±6)(圖3C)無顯著差異(圖4)，P＞0.05，提示隨時間延長可逆性蛋白酶體抑制劑MG132抑制作用消除，NSCs增殖能力恢復至正常水平。

討 論

NSCs是具有自我更新能力和多向分化潛能的未分化細胞。位于SVZ的NSCs是目前公認的成年個體NSCs最為集中的地方，分裂增殖產生的祖細胞可以長距離遷移至嗅球，是研究個體發育過程中NSCs生物學特性的最佳部位[5，6]。因此，本實驗選取SVZ作為目的腦區，通過 BrdU摻入實驗觀察NSCs增殖情況。BrdU是研究在體NSCs增殖和分化能力的一種確切可靠的標記方法，目前已被國際上廣泛應用[7，8]。本實驗結果顯示BrdU陽性NSCs分布于側腦室SVZ，BrdU陽性細胞著色部位為細胞核，可與細胞核特異性熒光染料DAPI重疊，證明染色結果特異性強，BrdU免疫熒光標記能夠客觀反映NSCs增殖情況。

Figure3.Immunofluorescent staining of BrdU in SVZ after injection of MG132 or DMSO at different time points.A:3 d DMSO group;B:7 d DMSO group;C:14 d DMSO group;D:3 d MG132 group;E:7 d MG132 group;F:14 d MG132 group.Bar=50 μm.圖3 MG132組和DMSO組注射后不同時點腦室室管膜下區BrdU免疫熒光表達

Figure4.Quantification of the number of BrdU+cells after injection of MG132 or DMSO at different time points.*P＜0.05 vs DMSO at the same time point;△P ＜0.05 vs 14 d.圖4 MG132組和DMSO組注射后不同時點BrdU陽性細胞數

蛋白酶體是一種高度保守的多價催化蛋白酶復合物，通過選擇性降解功能蛋白，介導DNA修復、細胞周期調控、基因轉錄調控以及信號轉導等多種生命活動[9]。應用蛋白酶體抑制劑改變蛋白酶體活性是目前研究蛋白酶體功能的重要手段。MG132是經典的蛋白酶體抑制劑，屬醛基肽類蛋白酶體抑制劑，它通過與蛋白酶體催化中心可逆性結合，抑制蛋白酶體活性，從而阻斷其對異常蛋白的降解。本實驗選擇側腦室注射10 μg MG132，結果顯示側腦室注射MG1323 d、7 d后能夠顯著抑制SVZ蛋白酶體活性，但隨注射時間延長，14 d后SVZ蛋白酶體活性恢復至正常水平，與DMSO對照組相比無明顯差別，表明側腦室注射MG132能夠可逆性調節SVZ蛋白酶體活性。

近年的研究結果表明隨年齡增加體內蛋白酶體活性持續降低[10]。Hwang 等[11]的研究結果顯示，50歲人群蛋白酶體活性僅為20歲人群的1/2，高齡人群蛋白酶體功能亞單位合成顯著減少。蛋白酶體功能異常將會導致細胞內氧化蛋白和泛素化蛋白堆積，這些結構和功能異常的蛋白產生細胞毒性作用從而引發細胞損傷。Chondrogianni等[12]應用蛋白酶體抑制劑作用于表皮成纖維細胞，細胞出現增殖能力降低、生長停滯以及凋亡跡象，細胞周期抑制因子p21、p16表達水平上調。若過表達蛋白酶體相關基因、改善蛋白酶體活性，則能增強細胞對氧化損傷的耐受力，提高細胞存活率[13]。本研究結果也證實，側腦室注射MG1323 d、7 d后蛋白酶體活性下降，SVZ BrdU+NSCs數量顯著減少;14 d后隨蛋白酶體活性恢復，BrdU+NSCs數量升至正常水平，表明蛋白酶體活性與NSCs增殖能力密切相關。干細胞的自我更新、激活、增殖、分化依賴于其生存的特殊微環境，即干細胞niche。有文獻報道蛋白酶體功能缺陷是帕金森、老年癡呆等神經退行性疾病的共同病因[14，15]。由此我們推測，蛋白酶體活性降低造成錯誤蛋白和氧化蛋白在體內蓄積[16]，破壞NSCs生存微環境，進而導致個體神經發育及再生障礙。然而，NSCs的增殖分化受多種信號通路調控，其過程錯綜復雜，蛋白酶體對NSCs增殖能力的調控機制尚待進一步研究。

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