黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元鈣調蛋白表達的影響*

閆鳳霞，錢 濤，高維娟，葉冬青，任立群，張雅麗，侯志平

(1承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000;2河北省人民醫院，河北 石家莊 050051;3河北化工醫藥職業技術學院，河北 石家莊 050026)

黃芪是中醫藥治療缺血性腦血管病的常用藥物，具有清除自由基、減輕腦水腫、對抗炎癥介質、緩解鈣離子超載、改善神經元能量代謝、降低興奮性氨基酸毒性等作用[1]。本課題組前期實驗證實，黃芪注射液可減輕全腦缺血再灌注損傷引起的大鼠海馬神經元凋亡，并可抑制離體培養大鼠海馬神經元因缺氧缺糖/復氧復糖所致的凋亡[2]，但黃芪注射液抑制神經元凋亡的機制尚不清楚。目前已知，鈣超載是引起細胞凋亡的重要因素之一，本研究通過對原代培養的大鼠海馬神經元施加缺氧缺糖/復氧復糖因素，模擬腦缺血再灌注損傷過程，觀察黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元鈣調蛋白(calmodulin，CaM)表達的影響，探討黃芪注射液抑制缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元凋亡的分子機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SD大鼠，新生24 h之內，雌雄兼有，清潔級動物，由河北省實驗動物中心提供，合格證號冀醫動字第702003號。

1.2 試劑和儀器 兔抗caspase－3多克隆抗體(非激活)購于北京中杉金橋公司。Caspase－3蛋白免疫組化SP試劑盒和Western blotting試劑盒購于北京中杉金橋公司。BCA蛋白定量試劑盒購于上海申能博彩生物公司。CaM RT－PCR引物由上海生物工程有限公司設計，RT－PCR試劑盒購自大連寶生物公司。DNaseⅠ、多聚賴氨酸和阿糖胞苷購自Sigma。胎牛血清和馬血清由HyClone生產。谷氨酰胺和胰蛋白酶購自華美生物工程公司。DMEM/F12培養基和B27由Gibco生產。黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產。其它試劑為國產分析純。主要儀器:HERAcell 150型CO2培養箱由Heraeus生產;Leica DMIL 090－135.001型倒置顯微鏡由Wetzlar GmbH生產;TDL－40B離心機購自上海安亭科學儀器制造廠。DYY－6B型穩壓穩流電泳儀購自北京六一儀器廠。

2 方法

2.1 海馬神經細胞的分離及培養 參照Brewer等[3]的方法并做少許改良，取新生24 h內的SD大鼠海馬組織，6.25 mmol/L胰蛋白酶消化，馬血清終止消化后將組織塊混合液移入離心管，加D－Hanks液1000 r/min離心5 min，去上清后加DMEM/F12溶液7 mL，吹打離散組織，制成細胞懸液，以200目濾網過濾。取細胞懸液在100倍倒置顯微鏡下計數，以 5×108/L密度接種在含有種植培養液(DMEM/F12培養基添加0.012 mol/L胎牛血清、0.014 mol/L馬血清、0.1 g/L谷氨酰胺、0.1 U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素)的培養皿或培養瓶中。2 d后用無血清培養液(DMEM/F12添加2%B27)代替種植液。培養第4 d換液時添加0.005 g/L阿糖胞苷以抑制膠質細胞生長，24 h后替換成新鮮無血清培養液。

2.2 缺氧缺糖/復氧復糖模型的建立與實驗分組參照Bossenmeyer等[4]的方法建立缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型:取原代培養8 d的大鼠海馬神經細胞，用無糖Earle's液沖洗2遍，然后加入與正常對照組培養液等體積的無糖Earle's液，隨即把培養皿(瓶)置于37℃溫箱中的缺氧裝置里，快速通入高純氮氣1 min以排盡缺氧裝置中的空氣，再使排氣水瓶中的氣體勻速緩慢連續排出。缺氧缺糖30 min后，換正常無血清培養液繼續在37℃、5%CO2培養箱內培養。大鼠海馬神經細胞隨機分為4組:正常對照組、缺氧缺糖/復氧復糖組、黃芪注射液溶劑對照組和黃芪注射液組。缺氧缺糖/復氧復糖組模型制備方法同上;正常對照組正常培養，不進行任何處理;黃芪注射液組于缺氧缺糖同時加入黃芪注射液，終濃度為0.5 g生藥/L，直至細胞培養結束;黃芪注射液溶劑對照組處理方法與黃芪注射液組相同，只是將黃芪注射液換為pH值7.4的等量黃芪注射液溶劑即無菌去離子水。各組在復氧復糖后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、48 h、72 h 和 120 h 檢測海馬神經細胞caspase－3和CaM的表達。

2.3 免疫組織化學染色法檢測caspase－3的表達細胞用99.5%丙酮4℃固定10 min，PBS洗3遍，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min，再用PBS洗3遍后放在濕盒中，用山羊血清封閉60 min，兔抗磷酸化caspase－3多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃過夜，PBS洗3遍，生物素標記的Ⅱ抗和辣根過氧化物酶依次在37℃下作用20 min，PBS洗后用DAB顯色，鏡下觀察核中出現黃色顆粒及胞漿黃染后及時終止，蘇木素復染7 min后用氨水反藍5 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明2次(各10 min)、中性樹膠封固。PBS代替Ⅰ抗作陰性對照。陽性細胞胞漿和突起呈棕黃色，胞核有黃色顆粒。陽性細胞計數方法:高倍鏡下計數5個非連續視野陽性細胞數之和，每組重復6次。并用圖像分析軟件Quantity One對各組細胞圖片進行分析，計算其A值。

2.4 蛋白免疫印跡法檢測細胞內CaM的表達 收集細胞，用細胞裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解、振蕩，12000 r/min 4℃離心20 min，提取胞漿蛋白，用BCA法進行蛋白定量。取100 μg樣品，加入蛋白體積1/4的loading buffer上樣緩沖液混勻，在100℃沸水中煮7 min，同時65℃水中孵育蛋白分子量標記(marker)，以12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉移法轉移到事先用甲醇激活的PVDF膜上，用配好的5%脫脂奶粉封閉液封閉，4℃過夜后加入用封閉液稀釋的兔抗磷酸化CaM多克隆抗體(1∶100稀釋)室溫搖床放置2 h。洗膜液洗3次，首次15min，后2次各10 min，用生物素標記的Ⅱ抗(1∶14000稀釋)孵育1 h，洗膜液洗后用DAB法顯色。以β－actin為內參照。實驗重復6次，目的條帶為16.7 kD。用Quantity One軟件對各時點蛋白條帶灰度值進行分析。

2.5 RT－PCR檢測細胞CaM mRNA的表達 收集細胞，用Trizol一步法提取RNA，按ExscriptTMRT reagent kit說明逆轉錄為cDNA。CaM cDNA上游引物5'－TGCGGCGTTACACGA CCTT －3'，下游引物5'－CAAAGCCAGTGGCACT CATTCTC － 3'，擴增片段長度為200 bp;內參照 β－actin的上游引物5'－GGACTTCGAGCAAGAGATGG－3'，下游引物 5'－ACATCTGCTGGAAGGTGGAC－3'，擴增片段長度為509 bp[5]。按照 PCR Amplification kit說明進行反應，擴增條件:95℃預變性3 min;94℃ 40 s，54℃40 s，72℃ 40 s，循環30次，最后72℃ 3 min。用質量分數為115%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，以β－actin為內參照，實驗重復6次。用凝膠分析軟件Quantity One進行半定量分析，目的條帶在115 bp處。

3 統計學處理

結 果

1 黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬caspase－3陽性神經元形態學的影響

免疫組織化學結果顯示:正常對照組大鼠海馬神經元核規整，細胞突起明顯，有少許細胞胞漿黃染。缺氧缺糖/復氧復糖組大鼠海馬神經元核皺縮、突起回縮，大量細胞胞漿黃染，胞核內有黃色顆粒，陰性對照組未見胞漿和突起黃染的陽性神經元;與正常對照組相比，除0 h和0.5 h之外，缺氧缺糖/復氧復糖組各時點海馬caspase－3陽性神經元數目、占神經元總數的百分率及平均吸光度值均明顯增多(P＜0.05)，于24 h達到高峰。黃芪注射液溶劑對照組海馬神經元亦可見到明顯的核皺縮、突起回縮和胞漿黃染，海馬caspase－3陽性神經元數目、占神經元總數的百分率及平均吸光度值的變化趨勢均與缺氧缺糖/復氧復糖組相一致(P＞0.05)。黃芪注射液組大鼠海馬神經元有輕微核皺縮，可見部分神經元胞漿黃染，除0 h和0.5 h之外，各時點陽性神經元數目，占神經元總數的百分率及平均吸光度值均比缺氧缺糖/復氧復糖組顯著減少(P＜0.05)。隨著復氧復糖時間的延長，缺氧缺糖/復氧復糖組、黃芪注射液溶劑對照組及黃芪注射液組均可見到陽性神經元胞核中黃色顆粒逐漸增多，于24 h達到高峰，見圖1－4。

Figure1.Caspase－3 expression in hippocampal neurons of rats defected by SP immunohistochemical staining method(×400).A:normal group;B:hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation group;C:Astragalus injection solution group;D:Astragalus injection group.圖1 免疫組化SP染色法檢測海馬神經元caspase－3的表達

Figure2.The effect of Astragalus injection on the numbers of caspase－3 positive neurons after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats..n=6.*P＜0.05 vs normal;#P＜0.05 vs model and solution.圖2 黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬caspase－3陽性神經元數目的影響

Figure3.The effect of Astragalus injection on the percentage of caspase－3 positive neurons after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats..n=6.*P＜0.05 vs normal;#P＜0.05 vs model and solution.圖3 黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬caspase－3陽性神經元百分率的影響

Figure4.The effect of Astragalus injection on mean absorbance(A)value of caspase－3 positive neurons after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats..n=6.*P＜0.05 vs normal;#P＜0.05 vs model and solution.圖4 黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬caspase－3陽性神經元平均吸光度值的影響

2 黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元CaM蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示，各時點缺氧缺糖/復氧復糖組海馬神經元CaM蛋白的平均吸光度值均較正常對照組明顯升高(P＜0.05);與缺氧缺糖/復氧復糖組相比，黃芪注射液溶劑對照組各時點CaM蛋白的平均吸光度值無明顯變化(P＞0.05)，而黃芪注射液組在各個時點CaM蛋白的平均吸光度值明顯降低(P ＜0.05)，見圖5。

3 黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元CaM mRNA表達的影響

RT－PCR結果顯示，各時點缺氧缺糖/復氧復糖組海馬神經元CaM mRNA的平均吸光度值均較正常對照組明顯升高(P＜0.05);與缺氧缺糖/復氧復糖組相比，黃芪注射液溶劑對照組各時點CaM mRNA的平均吸光度值無明顯變化(P＞0.05)，而黃芪注射液組在各個時點CaM mRNA的平均吸光度值明顯降低(P＜0.05)，見圖6。

Figure5.The effect of Astragalus injection on expression of CaM protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats.A:model group;B:solution group;C:Astragalus group.M:marker control;1:normal control;2:0 h;3:0.5 h;4:2 h;5:6 h;6:24 h;7:48 h;8:72 h;9:120 h..n=6.*P＜0.05 vs normal;#P＜0.05 vs model and solution.圖5 黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元CaM表達的影響

討 論

腦缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程，其導致神經元凋亡的機制涉及多個環節，鈣離子超載、自由基、能量代謝障礙等都參與了腦缺血再灌注損傷過程。這些因素之間相互構成網絡式聯系調控著神經元凋亡的進程。

Ca2+是細胞內重要的第2信使，Ca2+通過與特異性的Ca2+結合蛋白相互作用而發揮其功能。目前已發現與Ca2+結合的蛋白大概有100多種，而CaM是其中最重要的一種[6]。Ca2+與CaM 結合后會激活CaM，活化的CaM再激活其下游多個信號途徑，如蛋白激酶C、促分裂原活化蛋白激酶、磷酸化酶激酶、腺苷酸環化酶等，缺氧缺糖/復氧復糖后神經元內由于能量代謝障礙引起胞膜及內置網膜Ca2+通道開放，進而發生Ca2+超載會導致Ca2+/CaM依賴性激酶的持續性的激活，如Ca2+/CaMKⅡ、一氧化氮合酶、神經鈣蛋白等，而Ca2+/CaMKⅡ調節神經細胞的死亡過程[7]。有報道稱，神經鈣調蛋白的抑制劑也能夠減弱缺血后再灌注誘導的細胞毒性損傷[8]。JNK3作為MAPK的成員可被其上游 Ca2+/CaM依賴性激酶的激活，進而啟動下游caspase級聯反應，發揮其承上啟下作用;同時JNK3通過線粒體途徑激活caspase－3時引起線粒體膜通透性改變，使Ca2+大量釋放入胞漿而加重鈣超載，再次激活CaM和Ca2+/CaM依賴性激酶而活化JNK3形成惡性循環。

在腦缺血再灌注過程中，特別是缺血再灌注早期的氧自由基大量生成，利用其脂質過氧化作用，破壞神經元細胞膜，形成小裂隙，以及形成新的鈣通道，造成大量Ca2+內流。研究發現，氧自由基清除劑SOD和CAT均可以降低細胞內Ca2+[9]。高濃度的細胞內Ca2+很容易激活磷脂酶和鈣敏感性蛋白酶。磷脂酶A2和蛋白激酶C的活化可導致花生四烯酸形成，后者通過環氧化酶作用產生大量 H2O2和·OH。氧自由基還可以作用于線粒體膜，造成Ca2+順濃度梯度進入線粒體，使線粒體內鈣超載造成氧化磷酸化障礙，反過來又促進了自由基的生成[10]和Ca2+超載，這兩者相互聯系，協同作用，形成惡性循環，與前述惡性循環形成網絡，最終導致神經元不可逆損傷。如果應用藥物進行干預打斷惡性循環就能減少神經元的凋亡。

細胞凋亡過程中caspase－3處于核心位置，凋亡的最后實施通過caspase－3的激活而實現[11]。缺血再灌注損傷引起的氧自由基增加、鈣離子超載等損傷因素激活的凋亡信號轉導的線粒體途徑、死亡因子及其受體途徑、內質網途徑最終都會導致caspase－3活化，caspase－3被激活后可裂解其底物蛋白激酶C、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，使損傷DNA的修復不能進行;活化的caspase－3可直接激活其它的 caspases(caspase－2，－8，－7，－6等)，通過裂解DNA依賴的蛋白激酶、肌動蛋白、模板、甾醇調控的要素結合蛋白家族及異核核糖核苷蛋白家族，使DNA的損傷不能正常修復，引起核固縮，DNA裂解，凋亡小體形成。此外，活化的caspase－3可直接誘導線粒體凋亡途徑，加速Bcl－2降解，加速線粒體功能障礙和細胞色素C釋放，使凋亡信號不斷放大，涉及范圍不斷增加，最終引起細胞凋亡[12－15]。Caspase－3是caspase級聯“瀑布”下游最關鍵的凋亡蛋白酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后的樞紐作用[15]。研究表明caspase－3 mRNA表達在再灌注期先于凋亡發生，并且其表達時程較長，是檢測缺血再灌注凋亡的敏感指標。

本實驗證實:黃芪注射液可抑制缺氧缺糖/復氧復糖后海馬神經元caspase－3蛋白，從而抑制缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元的凋亡，而其機制可能是抑制CaM的生成及鈣超載。

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