首發精神分裂癥患者中ZNF804A rs1344706多態性與非典型抗精神病藥療效間的關聯分析*

吳小立，鐘智勇，魏欽令，刁飛慈，張晉碚，吳庭娟，熊天威

(中山大學附屬第三醫院心理科，廣東 廣州 510630)

精神分裂癥患者對抗精神病藥物的治療反應存在著顯著的個體差異已是一個不爭的臨床事實，一系列研究證據表明遺傳因素在其中扮演著重要角色[1]。在過去10年間，精神分裂癥危險基因的多態性，尤其是5－羥色胺(5－hydroxytryptamine，5－HT)和多巴胺受體2(dopamine receptor 2，D2)基因多態性與抗精神病藥物療效間的關聯分析是遺傳藥理學研究的熱點[2－5]。如今，全基因組關聯研究(genome－wide association studies，GWAS)已成功篩選出數個精神疾病易感基因[6，7]，然而，這些新發現的易感基因是否與抗精神病藥物的靶點有關，并進而影響這些藥物的臨床療效仍鮮為人知。

ZNF804A基因的多態性位點rs1344706為第一個全基因組關聯分析得到的精神分裂癥易感位點[8]，而且，其與精神分裂癥間的相關性已經得到一系列研究的證實，包括數個研究對象來自不同人群的全基因組關聯研究[9－11]和病例對照研究[12，13]。ZNF804A基因在大腦中廣泛表達，其編碼的蛋白質為具有一個C2H2結構域的鋅指蛋白，然而，其確切的生物學功能尚不清楚。Riley等[12]的研究表明，rs1344706多態性與ZNF804A的轉錄有關，攜帶T基因座的精神分裂癥患者腦組織內ZNF804A mRNA的轉錄水平顯著高于非攜帶者。Williams等[14]的研究進一步證明了rs1344706與轉錄水平有關，Williams根據eQTLs的檢測進一步指出:rs1344706多態性與基因轉錄間的關系與疾病并不相關。盡管目前人們對ZNF804A基因及其多態性rs1344706的功能所知甚少，數個研究利用影像學或神經心理學的方法還是粗略地概括出了與rs1344706相關的表型特征[15－18]。其中，Esslinger等[15]在健康受試者中進行N－back記憶任務測試發現，ZNF804A rs1344706A風險等位基因座T影響著背外側前額皮層和海馬結構之間腦功能的連續性。Walters等[18]研究則發現患者中rs1344706風險等位基因攜帶者比非攜帶者具有更好的認知功能表現。最近發表的精神疾病癥狀學和rs1344706的關聯研究報道則表明，精神分裂癥患者中T攜帶者可能具有更多的終生躁狂發作的次數以及終生病情可能更嚴重[19]。上述研究表明，ZNF804A基因內的rs1344706多態性可能與精神疾病的各種表型相關。鑒于對抗精神病藥物的治療反應屬于受遺傳因素影響的精神分裂癥的表型之一。本研究中，我們假設ZNF804A rs1344706與非典型抗精神病藥物的療效間可能存在關聯，選擇一群未曾經過藥物治療的首發精神分裂癥患者為研究對象，分析非典型抗精神病藥物(分別為奧氮平、齊拉西酮和阿立哌唑)治療4周，PANSS減分率與rs1344706基因型間的關系。

材料和方法

1 材料與儀器

PCR試劑購自寶生物工程有限公司;100bp DNA ladder購自上海威佳生物公司。PCR引物由北京華大生物有限公司合成。主要儀器:Bio－Rad DNA Engine PCR儀;Tanon DNA電泳儀。

2 研究對象

選取2010年2月－2011年2月在中山大學附屬第三醫院心理科接受治療的首發精神分裂癥住院患者71例，陽性和陰性癥狀量表(the positive and negative symptom scale，PANSS)≥60分，年齡18－35歲，平均(23.76±6.81)歲，平均病程(0.91±0.35)年，女35例，男36例，均符合:(1)美國精神障礙診斷與統計手冊第4版(DSM－Ⅳ)精神分裂癥的診斷標準;(2)系首次發作;(3)入組前1月未服用任何抗精神病藥物;(4)排除雙相情感障礙、器質性精神障礙、精神發育遲滯和癡呆;(5)排除藥物及酒精依賴者;(6)排除妊娠哺乳期及卵巢早衰女性患者;(7)排除現患嚴重和/或慢性軀體疾病者;(8)所有患者均知情同意參加本研究。

3 方法(自然臨床觀察實驗)

3.1 相關量表的評估 選取PANSS對患者予以精神評估，本量表兼顧了精神分裂癥的陽性和陰性癥狀及一般精神病理癥狀，其各量表重測信度指數為0.77－0.89，較全面地反映了患者的精神病理全貌，屬國際通用他評量表。所有患者基線及治療4周后均經過2名工作10年以上的精神科高年資主治醫師予以PANSS各評估1次，2位醫師量表評估一致性檢驗:κ=0.83。

3.2 給藥方案 經知情同意后參與研究的患者根據臨床需要分別進入奧氮平、阿立哌唑或齊拉西酮治療組接受單一抗精神病藥物治療4周。奧氮平(商品名再普樂，進口藥品注冊證號:20020002;選自美國Lily公司，規格是5 mg/片)，阿立哌唑口腔崩解片(商品名博思清，國藥準字H20060523)選自中國成都大西南制藥公司，規格是5 mg/片)，兩藥均自5 mg·d－1開始使用，在1周內調至20 mg ·d－1;齊拉西酮(商品名卓樂定，美國輝瑞公司生產，規格是40 mg/片，進口藥品注冊證號:H20070007)，初始劑量40－80mg·d－1，在1周內劑量調至160－200 mg·d－1，平均(168.28 ±16.49)mg·d－1。出現錐體外系癥狀者合并使用鹽酸苯海索，坐立不安或失眠嚴重者可合并使用勞拉西泮。

3.3 標本采集及基因組DNA提取 所有研究對象均于清晨8:00空腹狀態下采集外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝。低速離心去血漿，使用包含有150 mmol/L NH4Cl、10 mmol/L KHCO3和 0.1 mmol/L EDTA的血紅細胞裂解液從血樣中分離出白細胞，用SDS裂解液+蛋白酶K處理6 h后用苯酚/氯仿抽提蛋白，10000 r/min離心5 min后取上清，應用75%乙醇沉淀基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，提取的DNA放置－80℃保存備用。

3.4 ZNF804A基因rs1344706G/T位點多態性檢測應用PCR方法擴增基因組DNA，產生一段包含rs1344706位點，長度為483 bp DNA產物。上游引物GAATCTAGAGTCATGCAGG，下游引物 CAAGTTATTCTCTAGAGTCC。PCR反應條件:95℃預變性4 min，95 ℃ 40 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環，72℃ 10 min，40℃保存。PCR擴增產物由北京華大基因研究中心進行直接基因測序。隨機選取基因組DNA樣本進行PCR并重測序，重復測序和原始測序的一致性為100%。上述操作和分析由專門的生物技術人員進行，結果見圖1。

Figure1.The map of PCR from ZNF804A rs 1344706 samples.圖1 ZNF804A rs1344706部分樣本PCR圖

4 統計學處理

(http://ihg2.helmholtz － muenchen.de/cgibin/hw/hwa1.pl)基因型的Hardy－Weinberg平衡應用Software program Finetti檢測。3個基因型組間基線的人口學和臨床資料應用單因素方差分析(ANOVA)和卡方檢驗(當最小例數＜5時采用Fisher精確概率法檢驗分類變量)。以PANSS減分率()來表示治療反應，應用Pearson's相關系數檢驗年齡、首發年齡、性別、抗精神病藥類型、基線PANSS評分和治療反應間的關系，選擇顯著與治療反應有關的變量作為協變量，應用協方差分析(UNIANOVA)檢測基因型與PANSS減分率之間的相關性，組間比較采用LSD檢驗。所有資料應用SPSS for Windows 16.0統計軟件包進行分析，統計水準:P＜0.05。

結 果

1 rs1344706位點基因型檢測結果

直接測序基因分型ZNF804A基因rs1344706位點檢測到GG、GT、TT基因型，見圖2。基因型頻率分布均符合Hardy－Weinberg遺傳平衡(P＞0.05)，說明資料代表性好。

Figure2.The map of direct sequencing ZNF804A rs1344706 locus polymorphism.1:CC genotype;2:AA genotype;3:AC genotype.圖2 ZNF804A rs1344706位點多態性直接測序圖

2 一般臨床資料和人口學資料

71個首發精神分裂癥患者按基因型分為GG(19)、TT(11)和GT(41)3組，不同基因型組別之間，其性別、年齡、首發年齡、PANSS總分、PANSS陽性和陰性因子分、非典型抗精神病藥物的類型在基線均無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

表1 不同基因型組間的一般臨床資料和人口學資料Table1.Baseline characteristics of schizophrenia patients with three genotypes of ZNF804A rs1344706 polymorphism

3 ZNF804A基因型與PANSS評分之間的關聯分析

3.1 年齡、首發年齡、性別、基線PANSS總分與治療反應間無顯著相關，而抗精神病藥物類型與治療后的PANSS評分改善密切相關。初步方差分析顯示:ZNF804A基因rs1344706多態性與PANSS總分及陽性和陰性因子分的改善均顯著相關(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05);隨后，以抗精神病藥物類型作為協變量進行協方差分析發現:ZNF804A基因rs1344706多態性與PANSS總分及陽性因子分的改善仍呈顯著相關(均P＜0.05)。當將T攜帶者與純合子GG比較時，ZNF804A rs1344706多態性與PANSS總分及陽性因子分改善的關聯更顯著(均P＜0.01)，見表2。

表2 4周治療后不同基因型組間的PANSS減分率的比較Table2.Comparison of percentage changes in PANSS score of first－episode patients with different genotypes after 4－week treatment

3.2 與T等位基因攜帶者(TT+TG)相比，純合子GG型首發精神分裂癥患者的陽性因子分改善更顯著，見圖3。

Figure3.Association between rs1344706 genotypes and changes in positive PANSS scores.＊＊P ＜0.01 vs GG.圖3 rs1344706基因型與PANSS陽性因子分變化之間的關系比較

討 論

對抗精神病藥物的治療反應被認為是由遺傳因素決定的精神分裂癥表型之一[1]。過去數十年以來，多數的藥理遺傳研究聚焦在抗精神病藥物的靶目標上，諸如 5 －HT、D2 之類的受體[2，5]。盡管不少研究報道了上述基因多態性與治療反應間的關系，但精神分裂癥患者對抗精神病藥物治療反應差異的諸多原因仍不為人們所知。全基因組關聯研究方法的應用成功發現了幾個與主要精神疾病有關的基因變異[6]。這些新近發現的基因目前已經成為精神分裂癥病因學和精神病理學研究中的關注熱點。

本研究發現，首發精神分裂癥患者接受非典型抗精神病藥物治療后，ZNF804A rs1344706多態性與其陽性癥狀的改善密切關聯;GG純合子首發精神分裂癥患者的陽性癥狀對非典型抗精神病藥物治療的反應顯著優于T等位基因攜帶者。這一發現與目前國際上最新的相關研究報道(T等位基因與躁狂的終身發作次數和嚴重程度相關)相一致[19]。本研究中的3組首發精神分裂癥患者(TT、GT、GG)在基線時未發現PANSS評分有顯著差異，但是我們的研究對象均是首次發作并接受住院治療的精神分裂癥患者，就此而言他們必定病情偏重且多數患者有顯而易見的陽性癥狀，因此，我們的研究對象不能夠完全代表一般的漢族首發精神分裂癥患者，而本研究中rs1344706多態性與基線PANSS評分間的關系也不能推論到一般的漢族首發精神分裂癥總體。盡管如此，研究對象的嚴格入組標準還是排除了包括疾病病程和既往治療史在內的一些重要混雜因素。由于發現非典型抗精神病藥物類型也與治療反應有關，我們在分析中將其列為協變量再次進行了協方差分析，發現雖然關聯性有所下降卻仍然保持著統計學意義。不過，如要探明各個非典型抗精神病藥物療效與rs1344706多態性間的特異性關聯，則需要更大樣本量。

本研究是調查ZNF804A基因rs1344706多態性與非典型抗精神病藥物治療反應間關系的第一個臨床研究。公認非典型抗精神病藥比經典抗精神病藥對于5－HT和D2受體的親和力更高、臨床更有效。國外報道rs1344706的風險等位基因關聯著ZNF804A轉錄表達的增加[12]，且這種增加與疾病種類無關，盡管如此，亦不能排除ZNF804A基因與藥物療效相關的可能性。由于5－HT和/或D2受體所觸發的信號轉導級聯效應可能在非典型抗精神病藥物的治療反應中發揮重要作用，推測ZNF804A可能起著轉錄調節作用，且這一調節作用可能涉及到某個信號通路的下游。進一步闡明ZNF804A是否參與到5－HT和D2受體調節的信號通路中將有助于澄清多態性rs1344706與藥物治療反應差異之間的關聯。

綜上所述，本研究提示:ZNF804A rs1344706多態性與接受非典型抗精神病藥物治療的首發精神分裂癥患者的陽性癥狀改善程度密切關聯，但需要更大樣本的研究和其它種族樣本的研究進一步支持這一發現。

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