嗎啡誘導的CPP復燃大鼠前額葉皮層和海馬區EAAT3蛋白表達的變化*

劉 玲，付燕妮，何惠燕，紀風濤，劉付寧，曹銘輝△

(中山大學孫逸仙紀念醫院1麻醉科，2消毒供應中心，廣東 廣州 510120)

戒毒工作已成為一個緊迫的社會問題。在我國“防吸”工作開展普遍，“防復吸”工作卻做得相對較少[1]。復吸是指吸毒者在脫毒治療成功或停止用藥一段時間后，由于某些因素的激發，重現覓藥欲望而恢復用藥的行為，是藥物成癮的主要特征。我國復吸率普遍在90%以上，有的地區甚至高達95%以上。因此加強對阿片類藥物復吸機制的研究有重要的社會意義。大量研究證實，中腦腹側被蓋區(ventral tegmental area，VTA)到伏核(nucleus accumbens，NAc)的多巴胺(dopamine，DA)能投射是多種成癮物質引起獎賞效應的共同通路[2]。但越來越多的研究表示谷氨酸(glutamate，Glu)及 γ－氨基丁酸(γaminobutyric acid，GABA)遞質系統可能通過影響VTA－NAc的DA獎賞通路而強化阿片類藥物獎賞效應[3－5]。海馬及大腦皮層神經元主要的氨基酸轉運蛋白，即興奮性氨基酸轉運蛋白3(excitatory amino acid transporter 3，EAAT3)，在調控 Glu攝取速度及合成GABA方面發揮重要作用[6－8]。但嗎啡復吸過程中前額葉皮層及海馬區的EAAT3蛋白表達水平及其調控的 Glu/GABA信號如何變化，目前還不清楚。

條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)模型是研究藥物濫用的常用動物模型。臨床上已知誘發藥物濫用者戒斷后復吸的因素包括小劑量藥物暴露、應激、環境線索等。這些因素都可以在動物CPP模型上使消退后的CPP復燃，所以認為CPP建立消退后復燃可以反映阿片類藥物成癮復吸的生物學過程[9]。因此本研究通過建立CPP消退、復燃模型研究嗎啡復吸過程中前額葉皮層及海馬區EAAT3的蛋白表達變化規律，探討EAAT3在阿片類藥物復吸中可能的調控作用，為進一步防治復吸提供新的作用靶點及方向。

材料和方法

1 動物及主要試劑

40只健康成年SD大鼠，體重200－250 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物質量合格證編號為SCXK(粵)2008－0002。在中山大學動物中心適應3 d，12 h/12 h光照黑暗交替，自由進食。隨機分為5組:對照組(control)、CPP建立(establishment，Es)、消退(extinction，Ex)、復燃 2 h(reinstatement 2 h，Re2)、復燃4 h(reinstatement 4 h，Re4)組，8只/組。主要藥物試劑:鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥公司，批號為000355);多克隆兔抗EAAT3(1∶1000，Alpha Diagnostic International);HRP標記山羊抗兔 IgGⅡ抗(1∶2000，Amersham)。

2 實驗裝置

CPP箱，體積為60 cm×30 cm×30 cm，箱內中間有高為35 cm的可抽動隔板，將實驗箱分成兩個相同體積的長方形箱，一側箱為黑色，底面粗糙;另一側箱為白色，底面光滑。在整個實驗過程中保持箱內的光線、色調、氣味等環境條件的一致。

3 CPP模型的建立、消退及重現

3.1 在CPP建立前期 首先讓動物適應3 d:打開過渡箱中通向兩側行為箱的閥門，大鼠在CPP實驗裝置中自由活動15 min，每天1次，共3 d。第3 d大鼠在兩個行為箱中停留的時間作為基礎值，其中大鼠非自然偏好的行為箱被為伴藥箱，另一行為箱為非伴藥箱。

3.2 CPP建立期 關閉過渡箱的閥門，大鼠接受嗎啡(10 mg/kg)腹腔注射后放入伴藥箱50 min，或者接受相同體積的生理鹽水注射后放入非伴藥箱50 min，2次注射時間間隔為6 h，每天1次。對照組用生理鹽水代替嗎啡，其他處理相同。連續訓練10 d，訓練完成后第2 d進行CPP測試。Control組和Es組大鼠在CPP測試完成后2 h取材。其他3組繼續CPP消退及復燃階段訓練。

3.3 CPP消退期 Ex、Re2、Re4組大鼠給予等體積生理鹽水，注射后分別交替放入伴藥箱和非伴藥箱訓練50 min，連續訓練10 d。在訓練完成后第2 d再次打開過渡箱的閥門，記錄大鼠15 min內在兩個行為箱中停留的時間。Ex組大鼠在CPP測試完成后2 h取材。Re2、Re4組大鼠繼續復燃期的訓練。

3.4 CPP復燃期 Re2、Re4組大鼠腹腔注射小劑量嗎啡(2.5 mg/kg)，15min后進行CPP測試。Re2組在測試完成后2 h取材，Re4組在行為學測試完成后4 h取材。

4 Western blotting檢測前腦皮層及海馬區EAAT3蛋白表達變化

各組大鼠行為學測試完成后，于相應時點斷頭，取腦，放入冰冷的生理鹽水中，去除腦膜和血管，用眼科剪快速分離雙側前額葉皮層，海馬組織取材時一側海馬分離總蛋白，一側海馬根據Paxinos等[10]大鼠大腦解剖圖譜在橫冷切片機上分離CA1區。取出的組織液氮冷凍后超低溫冰箱儲存待測。以1∶10(即1 μg組織加入10 μL裂解液)的比例加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲下裂解細胞后，在冰上裂解30 min，4℃12000 r/min離心30 min，取上清。BCA法測定樣品的蛋白含量，用10%SDS－聚丙酰胺凝膠分離蛋白，30 μg/well樣品蛋白100 V電泳。然后將蛋白從聚丙酰胺凝膠轉移到NC膜，轉膜電壓為100 V，時間90 min。5%脫脂奶粉溶液于室溫下振蕩封閉1 h，多克隆兔抗EAAT3(1∶1000)及單克隆鼠抗β－actin(1∶5000)4度孵育過夜，TBST緩沖液沖洗3次，加標記辣根過氧化物酶標Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液沖洗3次，ECL曝光，高敏感X光片顯色。用Program Image J(Version 1.35)進行相對灰度值分析。具體方法參考文獻[11]。

5 統計學處理

采用SPSS 16.0統計學軟件進行統計處理。服從正態分布的計量資料以均數土標準差()表示，組間比較采用多組樣本的單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD法。

結 果

1 嗎啡誘導的大鼠CPP模型的建立、消退及復燃

與control組相比，經10 d訓練后的Es組大鼠在伴藥箱停留時間明顯延長(P＜0.05)，表明CPP模型建立成功。Ex組大鼠繼續進行10 d的生理鹽水訓練后，在伴藥箱停留的時間與control組比較無顯著差異(P＞0.05)。消退訓練結束后，以小劑量嗎啡(2.5 mg/kg)和伴藥箱作為引燃刺激，Re2組大鼠在伴藥箱停留時間較control組再次延長(P＜0.05)，提示CPP復燃模型建立。這種復燃狀態在小劑量嗎啡誘導4 h后的Re4組仍存在(P＜0.05)，見圖1。

2 嗎啡誘導的CPP建立、消退、復燃大鼠前額葉皮質EAAT3的蛋白表達變化

CPP建立時Es組前額葉皮質EAAT3較control組表達減少(P＜0.05);CPP消退時Ex組EAAT3蛋白表達回升;Re2組EAAT3表達與control組相比無明顯改變(P＞0.05);CPP重現4h后Re4組EAAT3蛋白表達又減少(P＜0.05)，見圖2。

3 嗎啡誘導的CPP建立、消退、復燃大鼠海馬區EAAT3的蛋白表達變化

Es、Ex、Re2、Re4 組大鼠海馬的 EAAT3 蛋白表達與control組相比差異無顯著(P＞0.05)，見圖3。而Es、Ex組海馬CA1區EAAT3蛋白含量比control組明顯增加(P＜0.05)，Re2、Re4組 EAAT3蛋白含量比CPP消退時降低，與control組相比差異無顯著(P ＞0.05)，見圖4。

Figure1.The time spent on the drug－paired side in rats of CPP establishment，extinction and reinstatement induced by morphine.Es:CPP establishment group;Ex:CPP extinction group;Re2:CPP reinstatement 2 h group;Re4:CPP reinstatement 4 h group..n=8.*P＜0.05 vs control group.圖1 嗎啡誘導的CPP建立、消退、重現大鼠在伴藥箱的停留時間

Figure2.Expression of EAAT3 in prefrontal cortex of rats in CPP establishment，extinction and reinstatement groups.Es:CPP establishment group;Ex:CPP extinction group;Re2:CPP reinstatement 2 h group;Re4:CPP reinstatement 4 h group..n=8.*P＜0.05 vs control group.圖2 各組大鼠前額葉皮層EAAT3蛋白表達變化

Figure3.The expression changes of EAAT3 in hippocampus of rats in CPP establishment，extinction and reinstatement groups.Es:CPP establishment group;Ex:CPP extinction group;Re2:CPP reinstatement 2h group;Re4:CPP reinstatement 4 h group..n=8.圖3 各組大鼠海馬區EAAT3蛋白表達變化

Figure4.The expression changes of EAAT3 in hippocampal CA1 area of rats in CPP establishment，extinction and reinstatement groups.Es:CPP establishment group;Ex:CPP extinction group;Re2:CPP reinstatement 2 h group;Re4:CPP reinstatement 4 h group..n=8.*P ＜ 0.05 vs control group.圖4 各組大鼠海馬CA1區EAAT3蛋白表達變化

討 論

CPP實驗是評價阿片類藥物獎賞效應和精神依賴的常用方法，所用嗎啡劑量一般在1－10 mg/kg之間，因所用劑量很低，動物一般不會產生明顯的生理依賴和戒斷癥狀[12]。CPP建立－消退－復燃模型則常用于動物藥物濫用復吸行為的評價[9，12]。我們的研究結果發現嗎啡誘導的CPP建立大鼠前額葉皮層EAAT3蛋白表達水平下降;停止給藥繼續訓練10 d后CPP消退，前額葉皮層EAAT3蛋白表達回升;用小劑量嗎啡(2.5 mg/kg)誘導CPP復燃4h后，前額葉皮層EAAT3表達水平再次下降，重現CPP時變化趨勢。而海馬CA1區EAAT3蛋白在CPP建立及消退時表達增加。

Glu是中樞神經系統內主要的興奮性遞質，在阿片類藥物的耐受、依賴形成與戒斷癥狀產生過程中起重要的調節作用。GABA是中樞內典型的抑制性神經遞質，由GABA能神經元釋放后可通過突觸后抑制減少下級神經元的興奮，也可作用于自身受體，產生突觸前抑制。根據Glu/GABA比值的變化可以判斷腦內神經系統的興奮或抑制狀態。海洛因誘發的復吸模型中發現伏核核心部Glu的含量增加[13]，抑制前額葉皮層功能、阻斷其向伏核的Glu投射可明顯抑制可卡因誘發的覓藥行為重現[3]。環境線索誘發的嗎啡復吸行為引起腹側海馬下托區細胞外GABA濃度下降[4]。而使用GABA受體激動劑baclofen激動GABAB受體明顯減輕嗎啡誘導的條件性位置偏愛行為[5]。提示前額葉皮層和海馬區Glu/GABA比值升高可能通過影響VTA－NAc的DA獎賞通路而強化阿片類藥物復吸行為。

突觸間隙的谷氨酸主要由神經元和膠質細胞膜上的興奮性氨基酸轉運體(excitatory amino acid transporters，EAATs)重攝取至胞內[14]，EAATs對谷氨酸的轉運能力明顯影響嗎啡依賴癥狀的形成[15，16]。EAAT3是神經元上主要的氨基酸轉運體，在海馬及大腦皮層高表達，是海馬及大腦皮層主要的谷氨酸轉運體之一[12]。研究發現，海馬神經元EAAT3由胞質向胞膜的轉移可增強神經元攝取Glu的能力，并參與突觸長時程增強早期的形成，這種作用不能被膠質細胞主要的氨基酸轉運體EAAT2抑制劑所抑制[6，7]。此外，EAAT3 在抑制性 GABA 能神經元中大量分布，突觸間隙中的Glu被EAAT3重新攝取進入GABA能神經元時，經谷氨酸脫羧酶催化轉化為抑制性的神經遞質GABA，從而調節GABA的合成。Sepkuty等[8]的研究顯示:反義鏈下調EAAT3基因表達的小鼠海馬神經元中GABA的濃度降低了50%，中間神經元的抑制能力下降，興奮性神經元的突觸傳遞增強。提示大腦皮層及海馬EAAT3在維持Glu/GABA平衡方面發揮重要作用。因此，CPP建立、復燃時前額葉皮層EAAT3蛋白表達水平下降，可能因其調節Glu和GABA的能力減弱，從而導致Glu/GABA比值升高，通過強化阿片類藥物的獎賞效應參與嗎啡復吸的形成。

而海馬根據細胞形態及纖維排列的不同分為CA1、CA3、DG區等多個區域。不同區域功能也不盡相同，生理生化指標變化也常有不同。研究發現，海馬CA1區顯微注射NMDA受體阻滯劑阻斷Glu信號的作用能有效抑制小劑量嗎啡誘導的復吸行為[17]，提示CA1區可能在嗎啡復吸中發揮重要作用。本實驗海馬總蛋白表達水平雖未見明顯改變，但海馬CA1區EAAT3在CPP建立及消退時表達增高，可能是對嗎啡誘導CPP建立及消退時Glu信號增強的代償性改變。對海馬其他腦區在嗎啡復吸中的作用，還需進一步研究。

本研究的結果顯示，小劑量嗎啡誘導CPP消退復燃大鼠前額葉皮層EAAT3蛋白表達水平降低，推測EAAT3蛋白表達降低可能導致Glu/GABA平衡失調而參與嗎啡復吸行為的形成。

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