牛磺酸對(duì)彌漫性腦創(chuàng)傷大鼠腦葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響*

李新娟， 李曉娟， 姜洪波， 李東亮△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，2第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

彌漫性腦創(chuàng)傷(diffuse brain injury，DBI)發(fā)生率和致殘率較高，嚴(yán)重危害著人們的生命與生活，但目前對(duì)其治療尚無特效方法。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DBI后可引起缺血缺氧［1］，缺血缺氧導(dǎo)致腦內(nèi)代謝異常乃至能量衰竭，是引起腦神經(jīng)元損傷壞死的重要原因，因此在DBI后缺血缺氧條件下神經(jīng)元能否從細(xì)胞外獲得足夠的能量是其能否生存的關(guān)鍵。腦組織對(duì)血液中葡萄糖的持續(xù)供應(yīng)具有依賴性，而血液中的葡萄糖通過血－腦屏障進(jìn)入腦組織需要相應(yīng)的運(yùn)載工具，即葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(glucose transporter，GLUT)來完成［2］，故GLUT在腦組織糖代謝及能量代謝過程中的作用顯得極其重要。

牛磺酸(taurine，Tau)為人體條件性必需氨基酸，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)牛磺酸具有神經(jīng)保護(hù)作用［3］。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸可通過下調(diào)DBI大鼠腦皮層基質(zhì)金屬蛋白酶3的表達(dá)發(fā)揮對(duì)DBI的保護(hù)作用［4］。但關(guān)于牛磺酸對(duì)DBI大鼠腦GLUT的影響國內(nèi)外尚未見報(bào)道，值得探討。本研究通過觀察牛磺酸對(duì)DBI大鼠腦葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glucose transporter 1，GLUT1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3(glucose transporter 3，GLUT3)蛋白表達(dá)和大腦病理形態(tài)學(xué)的影響，探討牛磺酸腦保護(hù)作用的可能機(jī)制，為更好地預(yù)防與治療DBI提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 牛磺酸購自Sigma，羊抗鼠55kD的GLUT1和GLUT3多克隆抗體購自Santa Cruz，免疫組化檢測試劑盒、堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗山羊IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，預(yù)染低分子量蛋白質(zhì)marker購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 動(dòng)物 雄性Sprague－Dawley大鼠64只，體重280－320 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥方法 SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦創(chuàng)傷組和低、高劑量牛磺酸組，每組16只。各組隨機(jī)分為2個(gè)亞組，每亞組8只，一亞組作免疫組織化學(xué)測定，另一亞組作Western blotting和透射電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)前7 d各組分別給藥，低劑量牛磺酸組給予牛磺酸 200 mg·kg－1·d－1，ig;高劑量牛磺酸組給予牛磺酸 300 mg·kg－1·d－1，ig;假手術(shù)組和腦創(chuàng)傷組給予 6 mL·kg－1·d－1生理鹽水，ig。

2.2 模型的制備 實(shí)驗(yàn)的第8 d，按照 Marmarou等［5］的方法制備DBI模型，致傷前0.5 h注射阿托品(0.1 mg/kg，ip)，3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg，ip)麻醉動(dòng)物，沿頭部中線矢狀切開頭皮約15 mm，剝離骨膜顯露冠狀縫及人字縫，將直徑10 mm、厚3 mm的不銹鋼墊片固定在大鼠冠狀縫與人字縫之間正中。待大鼠將要蘇醒時(shí)，將大鼠俯臥位固定于海棉致傷床上，置于致傷架下，用重450 g、直徑18 mm的銅棒從75 cm高度的垂直玻璃落體管自由落下，擊中墊片后迅速移開大鼠，取出墊片，消毒、縫合。假手術(shù)組僅麻醉、切皮、固定墊片、取出墊片、消毒及縫合，但不致傷。腦創(chuàng)傷后24 h進(jìn)行以下操作。

2.3 腦GLUT蛋白免疫組織化學(xué)檢測 4%多聚甲醛灌注后取腦、固定、脫水、二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，冠狀連續(xù)切片，片厚5 μm，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎梅巧锼囟椒庖呓M織化學(xué)技術(shù)，常規(guī)脫蠟水化，微波修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶20 min，I抗4℃過夜，II抗37℃30 min，底物用二氨基聯(lián)苯胺顯色，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

2.4 腦GLUT蛋白Western blotting檢測 大鼠深度麻醉后處死，迅速斷頭取腦，去除嗅腦、小腦和低位腦干，沿失狀縫平分腦組織，一半迅速－70℃冰箱保存?zhèn)溆茫硪话胱鲭婄R觀察。腦組織蛋白抽提后，Bradford法測定蛋白濃度，加入等體積的6×SDS上樣緩沖液煮沸5 min，以40 μg/well加樣經(jīng)5%積層膠后進(jìn)行10%分離膠SDS－PAGE電泳，在4℃冰箱內(nèi)，用45 mV電壓使樣品跑至分離膠后，用90 mV電壓電泳至溴酚蘭距離底線1 cm左右。電泳后在4℃冰箱內(nèi)，用190 mA電流進(jìn)行電轉(zhuǎn)移20 h。取出硝酸纖維素膜，封閉后加GLUT1(1∶500稀釋)或GLUT3(1∶500稀釋)37℃振搖孵育1.5 h，堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗羊II抗(1∶1000稀釋)37℃振搖1 h;用現(xiàn)配制的含 16.5 μL BCIP、33 μL NBT 和堿性磷酸酶緩沖液5 mL的顯色液，37℃避光顯色3－5 min，至目的條帶出現(xiàn);自來水沖洗終止顯色，吸水紙吸干硝酸纖維素膜上水分，避光干燥保存，1周內(nèi)照相。Band-Scan 5.0凝膠圖像處理軟件進(jìn)行蛋白灰度分析，各組GLUT1和GLUT3條帶灰度值與β－actin蛋白條帶灰度值的比值為相對(duì)灰度值(relative gray)，分別代表各組GLUT1和GLUT3的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 電鏡觀察 每組各取3只大鼠，腦切片用H－7500透射電子顯微鏡觀察大腦皮層病理形態(tài)學(xué)改變。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 GLUT免疫組織化學(xué)結(jié)果

各組腦組織中均可見有GLUT1表達(dá)的陽性細(xì)胞，其表現(xiàn)為在微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿或胞膜呈棕黃色。假手術(shù)組和腦創(chuàng)傷組大腦皮層可見少量GLUT1陽性細(xì)胞表達(dá)，見圖1A、B;低、高劑量牛磺酸組大腦皮層GLUT1陽性細(xì)胞表達(dá)增多，見圖1C、D。

Figure 1.The immunohistochemistry result of GLUT1 expression in cerebral cortex of rats with DBI(×400).A:sham －operated group;B:DBI group;C:low－dose taurine(200 mg/kg)group;D:high－dose taurine(300 mg/kg)group.Scale:30 μm.圖1 DBI大鼠大腦皮層GLUT1免疫組織化學(xué)結(jié)果

各組僅在第三腦室周圍可見GLUT3表達(dá)的陽性神經(jīng)元，陽性細(xì)胞胞漿或胞膜呈棕黃色。假手術(shù)組可見少量GLUT3陽性細(xì)胞表達(dá)，見圖2A;腦創(chuàng)傷組GLUT3陽性表達(dá)增多，見圖2B;高、低劑量組GLUT3陽性表達(dá)強(qiáng)于腦創(chuàng)傷組，見圖2C、D。

2 牛磺酸對(duì)DBI大鼠腦GLUT表達(dá)的影響

Western blotting電泳條帶灰度分析結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，腦創(chuàng)傷組大鼠腦GLUT1蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05);與腦創(chuàng)傷組相比，低、高劑量牛磺酸組腦GLUT1蛋白表達(dá)顯著增多(P＜0.01);且低劑量牛磺酸組腦GLUT1蛋白表達(dá)顯著高于高劑量牛磺酸組(P＜0.05)，見圖3。

與假手術(shù)組相比，腦創(chuàng)傷組大鼠腦GLUT3蛋白表達(dá)顯著增多(P＜0.01);與腦創(chuàng)傷組相比，低、高劑量牛磺酸組腦GLUT3蛋白表達(dá)顯著增多(P＜0.01);且高劑量牛磺酸組腦GLUT3蛋白表達(dá)顯著高于低劑量牛磺酸組(P＜0.01)，見圖4。

3 牛磺酸對(duì)DBI大鼠大腦皮層病理形態(tài)學(xué)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示:假手術(shù)組大腦皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)未見明顯異常，見圖5A;腦創(chuàng)傷組大腦皮層神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹、嵴混亂或斷裂，可見線粒體空泡化，偶見線粒體膜破裂、消失，細(xì)胞器數(shù)量減少，胞核異染色質(zhì)邊集，見圖5B;牛磺酸能明顯改善創(chuàng)傷腦組織病理改變，且低劑量牛磺酸組改善明顯。電鏡結(jié)果顯示低劑量牛磺酸組大腦皮層神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)偶見線粒體嵴腫脹和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞核內(nèi)異染色質(zhì)僅有小部分邊集，見圖5C;高劑量組大腦皮層神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)偶見線粒體髓樣變性和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞核內(nèi)異染色質(zhì)有小部分邊集，見圖5D。

Figure 2.The immunohistochemistry result of GLUT3 expression in the periphery of the third ventricle of rats with DBI(×400).A:sham－operated group;B:DBI group;C:low－dose taurine(200 mg/kg)group;D:high－dose taurine(300 mg/kg)group.Scale:30 μm.圖2 DBI大鼠第三腦室周圍GLUT3免疫組織化學(xué)結(jié)果

Figure 3.Effects of taurine on GLUT1 expression in the brain of rats with DBI.A:sham －operated group;B:DBI group;C:low－dose taurine(200 mg/kg)group;D:high－dose taurine(300 mg/kg)group..n=8.＊＊P ＜0.01 vs B group;#P ＜0.05 vs D group.圖3 牛磺酸對(duì)DBI大鼠腦GLUT1表達(dá)的影響

Figure 4.Effects of taurine on GLUT3 expression in the brain of rats with DBI.A:sham －operated group;B:DBI group;C:low－dose taurine(200 mg/kg)group;D:high－dose taurine(300 mg/kg)group..n=8.＊＊P＜0.01 vs B group;##P ＜0.01 vs C group.△△P ＜0.01 vs A group.圖4 牛磺酸對(duì)DBI大鼠腦GLUT3表達(dá)的影響

Figure 5.Ultrastructure changes of cortical neurons in DBI rats(×20000).A:sham－operated group;B:DBI group;C:lowdose taurine(200 mg/kg)group;D:high－dose taurine(300 mg/kg)group.圖5 DBI大鼠大腦皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化

討 論

腦的生化特點(diǎn)決定腦組織對(duì)血液中葡萄糖的持續(xù)供應(yīng)具有依賴性，而葡萄糖須在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)下通過易化擴(kuò)散進(jìn)入腦組織［2］，腦組織中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體主要是GLUT1和GLUT3，GLUT1主要分布在構(gòu)成血－腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞上，負(fù)責(zé)將葡萄糖從血液中跨血－腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)至腦細(xì)胞外間隙;GLUT3又稱神經(jīng)元葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要分布在神經(jīng)元胞膜上，負(fù)責(zé)將葡萄糖從細(xì)胞外間隙轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元內(nèi)［6］。因此在腦組織的糖代謝及能量供給過程中GLUT1和GLUT3的作用顯得尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組腦組織中均可見有GLUT1表達(dá)的陽性細(xì)胞，其表現(xiàn)為在微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿或胞膜呈棕黃色;各組僅在第三腦室周圍可見GLUT3表達(dá)的陽性神經(jīng)元。其中假手術(shù)組腦組織可見少量GLUT1和GLUT3蛋白表達(dá);與假手術(shù)組相比較，腦創(chuàng)傷組GLUT1蛋白表達(dá)未明顯增加，但GLUT3表達(dá)顯著增加，與Hamlin等［7］建立大鼠DBI模型實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果相一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大鼠DBI后葡萄糖從血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至腦細(xì)胞外間隙的量與假手術(shù)組相比并未增加，而轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外間隙的葡萄糖由于DBI后缺血缺氧僅能以無氧酵解的形式供應(yīng)能量，所供應(yīng)的能量遠(yuǎn)少于正常腦組織，因此創(chuàng)傷后腦內(nèi)能量物質(zhì)匱乏;而腦創(chuàng)傷組GLUT3表達(dá)增多可能認(rèn)為是腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元急性防御反應(yīng)的一部分，又反映了DBI后神經(jīng)元對(duì)葡萄糖的利用需求增多，GLUT3表達(dá)增多可能使更多的葡萄糖從腦細(xì)胞外間隙轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元內(nèi)，增強(qiáng)葡萄糖攝取［8］，進(jìn)而促使神經(jīng)元能量代謝的恢復(fù)。總之，腦創(chuàng)傷后腦內(nèi)能量物質(zhì)匱乏，且腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元對(duì)能量的需求增加，而能量物質(zhì)匱乏是引起腦神經(jīng)元損傷壞死的重要原因。因此在DBI后缺血缺氧條件下腦組織能否從細(xì)胞外獲得足夠的葡萄糖是其能否生存的關(guān)鍵。

牛磺酸是一種內(nèi)源性氨基酸，在神經(jīng)、血管平滑肌和骨骼肌的可興奮組織中含量最豐富，具有抗興奮性神經(jīng)毒性、抗自由基、穩(wěn)定細(xì)胞膜等多方面的神經(jīng)保護(hù)作用［9，10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低、高劑量牛磺酸組腦GLUT1和GLUT3蛋白表達(dá)較腦創(chuàng)傷組顯著增加，且低劑量牛磺酸組GLUT1表達(dá)顯著高于高劑量牛磺酸組，而高劑量組GLUT3蛋白表達(dá)顯著高于低劑量組，結(jié)果表明牛磺酸可使大鼠腦創(chuàng)傷后腦GLUT1和 GLUT3蛋白表達(dá)增加，且 GLUT1和GLUT3可能對(duì)牛磺酸劑量的敏感性不一樣，其最佳劑量有待進(jìn)一步研究。Sharp等［11］研究表明GLUT1表達(dá)增加有利于葡萄糖從血液經(jīng)血－腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)入腦細(xì)胞外間隙，促使腦內(nèi)葡萄糖水平增加，而較高的葡萄糖儲(chǔ)備是增加腦內(nèi)ATP合成的前提條件，對(duì)于維持腦組織能量供給，延遲能量衰竭引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)有重要意義;Vannucci等［12］研究認(rèn)為GLUT3表達(dá)升高可增加神經(jīng)元對(duì)葡萄糖的攝入，有助于恢復(fù)神經(jīng)元的能量代謝，對(duì)腦組織有保護(hù)作用;另外本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)牛磺酸能明顯改善DBI大鼠腦組織病理改變，這些強(qiáng)烈提示牛磺酸可對(duì)DBI大鼠發(fā)揮腦保護(hù)作用，其機(jī)制可能是上調(diào)GLUT1和GLUT3蛋白表達(dá)，維持腦組織的能量供給。在本研究的基礎(chǔ)上，探討牛磺酸對(duì)DBI腦組織葡萄糖攝取率的影響，進(jìn)一步證明牛磺酸腦保護(hù)作用是否與葡萄糖攝取率有關(guān)，還待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來探討。

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