3－甲基腺嘌呤對Aβ(25－35)引起的海馬神經(jīng)元凋亡的影響*

郭燕君，徐 營，沈忠飛，曾憲智，郭連軍，葉先才

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，浙江 嘉興 314001)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是多發(fā)于老年人、以近期記憶障礙為主要臨床癥狀、以老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)為主要病理改變的進行性神經(jīng)退行性疾病，其病因及發(fā)病機制尚不清楚。眾多研究者從不同的角度提出了各種發(fā)病假說，目前認(rèn)為其神經(jīng)元最終死亡形式為細(xì)胞凋亡。近年來的研究顯示自噬對于致病性Aβ和細(xì)胞骨架相關(guān)tau蛋白的生成和代謝都有密切關(guān)系，且其對神經(jīng)元的死亡也有特殊作用。隨著自噬的生理機制不斷被闡明，其在阿爾茨海默病中的作用得到廣泛重視。自噬功能在AD中確切作用的研究還僅處于起始階段。其對 β 淀粉樣肽(amyloid β -peptide，Aβ)、tau蛋白和神經(jīng)元變性死亡的作用還沒有得到完全闡明。學(xué)者們提出自噬功能具有保護作用，也可能是一種致病因素。自噬這把“雙刃劍”的分界線尚不明了，新近研究發(fā)現(xiàn)自噬參與調(diào)節(jié)阿爾茨海默病病理過程中Aβ的聚集和β淀粉樣肽蛋白前體(amyloid-β peptide protein precursor，APP)的代謝，但是有關(guān)自噬對阿爾茨海默病大鼠海馬神經(jīng)元凋亡之間的相互關(guān)系尚未見報道。本研究通過使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)干預(yù)阿爾茨海默病模型大鼠，探討自噬對阿爾茨海默病大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，為阿爾茨海默病的防治和新藥靶位的發(fā)現(xiàn)提供新思路。

材料和方法

1 材料

Aβ(25-35)(Sigma)用無菌生理鹽水配制成2 g/L，37℃下孵育1周，使其變?yōu)槟蹜B(tài) Aβ(25-35)。3-MA購自Sigma。3-MA用0.9%生理鹽水配制成100 mmol/L。ECL顯色劑，Lot#47，Amersham Biosciences產(chǎn)品。BCA蛋白分析試劑盒，Lot#EF60975，Pierce產(chǎn)品。β-actin抗體，Sigma產(chǎn)品。Beclin-1(H-300)兔多克隆抗體，sc-1142，Santa Cruz產(chǎn)品。FITC-conjugated驢抗兔 IgG，Jackson Immuno Research Laboratories產(chǎn)品。Eclipse TE2000-U型倒置熒光顯微鏡(Nikon)，PowerPac Basic電泳儀(Bio-Rad)，F(xiàn)C500型流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter)，H600透射電子顯微鏡(Hitachi)。

2 方法

2.1 AD模型的制備及給藥 SD大鼠，無菌級，雄性，體重250-300 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。經(jīng)Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院產(chǎn)品)測試判定其空間辨別性學(xué)習(xí)記憶能力，淘汰反應(yīng)過于遲鈍或特別敏感的大鼠，將選出的大鼠隨機分為3組，Aβ(25-35)組、NS組和3-MA預(yù)處理組，每組12只。Aβ(25-35)組雙側(cè)海馬區(qū)注射點(AP-3.5 mm，ML±2.0 mm，DV 2.7 mm)，用微量進樣器(上海高欣玻璃儀器廠產(chǎn)品)注射5 μL(10 μg)Aβ(25-35)[聚集態(tài)的 Aβ(25-35)形成]，10 min內(nèi)注完。NS組注射等量的生理鹽水。3-MA預(yù)處理組于注射Aβ(25-35)之前在雙側(cè)海馬區(qū)注射點注射3-MA 1 μL(100 mmol/L)。各組術(shù)后均單籠飼養(yǎng)至大鼠完全清醒。術(shù)后第8 d開始進行行為測試。

2.2 行為學(xué)檢測 Morris水迷宮測定行為于手術(shù)后第8 d開始，歷時5 d，第1 d讓大鼠自由游泳2 min;第1 d第2次開始訓(xùn)練，隨后每天訓(xùn)練4次，共5 d。訓(xùn)練時選擇1個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺的路線圖、所需時間(潛伏期)及各象限的游泳距離和時間。如果大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺，需將其引至平臺。這時潛伏期為60 s，每次訓(xùn)練間隔30 s。數(shù)據(jù)采集和處理由Morris迷宮圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)完成。

2.3 海馬細(xì)胞凋亡的測定 大鼠麻醉后，迅速斷頭取腦，取出雙側(cè)海馬，用0.01 mol/L PBS(pH 0.4)1-2 mL洗1次，吸出PBS，用剪刀剪碎海馬組織，用PBS洗1次，0.25%胰酶37℃消化30 min，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，終止胰酶消化，200目濾網(wǎng)過濾，0.01 mol/L PBS漂洗，800 r/min離心10 min然后用70%冷乙醇固定24 h以上。在上機前經(jīng)過800 r/min離心10 min，棄去固定液，0.01 mol/L PBS沖洗后用相同轉(zhuǎn)速離心10 min棄去 PBS，用100 μL，1 g/L RNA酶于37.5℃水浴30 min，再加入400 μL(50 mg/L)的PI(5 mg PI+0.1 mL Triton X-100+3.7 mg EDTA+10 mL PBS)染色15 min后上機檢測。細(xì)胞凋亡檢測分析:細(xì)胞懸液經(jīng)處理后，上機作DNA含量的測定，每個樣本測1000個細(xì)胞，經(jīng)計算機處理得出該細(xì)胞群體的DNA含量分布，繪出其直方圖。在G2峰的左側(cè)可以見到凋亡細(xì)胞(亞Gn期)趨群。計算出該群細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)。

2.4 透射電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)的觀察 每組隨機取3只大鼠，灌注、固定后取腦并進行后固定1 h。分離海馬CA1區(qū)，1%鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，TY-450超薄切片機切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，H600型透射電鏡觀察、攝片。對每只標(biāo)本每側(cè)在海馬CA1區(qū)注射針道周圍隨機選取2張銅網(wǎng)觀察，每只銅網(wǎng)在海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞區(qū)域拍照。

2.5 Western blotting法檢測大鼠海馬beclin-1蛋白的表達(dá) 行為學(xué)測試后處死各組大鼠，取出海馬，置于300 μL組織裂解液中，超聲細(xì)胞破碎儀低溫勻漿后提取上清，應(yīng)用BCA蛋白分析試劑盒測蛋白水平，并將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)成3 g/L，樣品按4∶1加入5×上樣緩沖液，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，其中分離膠10%，濃縮膠5%。恒壓70V電泳至分離膠底部;恒壓90 V 40 min轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h后，加入1∶2000 beclin-1(H-300)兔多克隆抗體，搖床上振搖1 h或過夜，用含Tween-20的磷酸緩沖液(TBST)洗滌3次，每次10 min，再加入1∶3000的驢抗兔IgG-HRP，搖床上振搖2 h，TBST洗滌3次，每次10min。ECL試劑顯色、曝光，并用掃描儀進行掃描。用Photoshop CS2軟件分析各條帶灰度值，以目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值的比值表示目的條帶的相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

結(jié) 果

1 3－MA對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

以大鼠Morris水迷宮找到平臺所需時間為檢測學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)，從第2 d到第5 d，3-MA預(yù)處理組與Aβ(25-35)組相比，所需時間明顯增加(P＜0.05)，NS組與Aβ(25-35)組相比差異顯著(P ＜0.05)，見表1。

2 3－MA對AD模型大鼠海馬細(xì)胞凋亡的影響

3-MA預(yù)處理、Aβ(25-35)組及NS處理組，3組海馬細(xì)胞凋亡率分別為17.85% ±3.36%、8.82%±1.76%及4.02% ±1.05%，見表2、圖1。3-MA預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率大于Aβ(25-35)組，Aβ(25-35)組細(xì)胞凋亡率大于NS組，3-MA預(yù)處理組和Aβ(25-35)組相比，兩者之間的差別顯著(P＜0.05)，見表2。Aβ(25-35)組與NS組相比差異顯著(P ＜0.05)，見表2、圖1。

表1 3－MA對Aβ(25－35)損傷海馬致AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響Table1.Effect of 3-MA on learning and memory in AD rats induced by hippocampal lesions due to Aβ(25-35)(.n=12)

表1 3－MA對Aβ(25－35)損傷海馬致AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響Table1.Effect of 3-MA on learning and memory in AD rats induced by hippocampal lesions due to Aβ(25-35)(.n=12)

*P ＜0.05 vs Aβ(25-35)group.

Group Day 2 Day 3 Day 4 Day 53-MA 47.01±18.90* 41.98±23.85* 40.93±19.49* 39.37±22.15*Aβ(25-35) 36.29±23.17 21.22±18.79 20.03±15.90 17.71±11.40 NS 34.84±20.50 17.67±21.36* 15.12±21.02* 10.36±15.21*

表2 3－MA對Aβ(25－35)致AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響Table2.Effect of 3-MA on apoptotic rate of hippocampal neurons in AD rats induced by Aβ(25-35)(.n=12)

表2 3－MA對Aβ(25－35)致AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響Table2.Effect of 3-MA on apoptotic rate of hippocampal neurons in AD rats induced by Aβ(25-35)(.n=12)

*P＜0.05 vs Aβ(25-35)group.

Group Apoptotic rate(%)3-MA 17.85±3.36*Aβ(25-35) 8.82±1.76 NS 4.02±1.05*

Figure1.Effects of 3-MA on the apoptosis of Aβ(25-35)-treated neurons(images of flow cytometry).A，B:treated with Aβ(25-35);C，D:pretreated with 3-MA;E，F(xiàn):treated with normal saline.The apoptotic rates of A to F were 17.0%，18.7%，8.8%，10.2%，4.5%and 4.2%，respectively.圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測3－MA對Aβ(25－35)致AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

3 3－MA對海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及自噬泡的影響

透射電鏡下，3-MA預(yù)處理組錐體細(xì)胞核周水腫，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池擴張。核染色質(zhì)凝聚、邊聚，在核膜下形成結(jié)節(jié)或半月狀團塊，有的細(xì)胞核呈現(xiàn)裂解，核膜破裂不完整，可見部分被雙層膜包裹形成自噬泡，染色質(zhì)邊聚等凋亡改變。這些現(xiàn)象可以初步判斷錐體細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。雙層膜包裹形成的自噬泡較少，見圖2A。Aβ(25-35)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞，細(xì)胞核重度固縮，核膜出現(xiàn)皺褶，核染色質(zhì)不均勻分布，細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，狀態(tài)差，見圖2B。NS組錐體細(xì)胞胞漿內(nèi)可見豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，見圖2C。在胞質(zhì)內(nèi)可見較多的核糖體以及線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞器尚屬正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，多數(shù)細(xì)胞狀態(tài)仍然較好。

4 自噬蛋白beclin－1的檢測

Western blotting檢測結(jié)果顯示，beclin-1蛋白在3-MA預(yù)處理、Aβ(25-35)及NS處理3組中的相對灰度值分別為0.20±0.02、0.61±0.03及0.36±0.05，見圖3。預(yù)處理給予自噬抑制劑3-MA后，自噬啟動的標(biāo)志蛋白beclin-1表達(dá)降低。3-MA預(yù)處理組與Aβ(25-35)組相比，以及Aβ(25-35)組和NS組之間比較，均有顯著差異(P＜0.05)，見圖3。

討 論

Figure2.Ultrastructure of hippocampal neurons observed by transmission electron microscope(×12000).A:pretreated with 3-MA;B:treated with Aβ(25-35);C:treaded with normal saline.N indicates nucleus.Solid arrows indicate cytoplasm edema.Horizotal open arrows indicate lysosomes and autophagic vacuoles.Vertical arrows indicate nuclear membrane shrink and uneven distribution of chromatin.圖2 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

Figure3.Expression of beclin-1 protein detected by Western blotting..n=12.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs Aβ(25-35)-treated rats.圖3 Western印跡法檢測beclin－1蛋白表達(dá)

體內(nèi)Aβ大量聚集是公認(rèn)的導(dǎo)致神經(jīng)毒性的危險因素之一，在動物體內(nèi)注射Aβ是常見的AD模型建立方法。在大鼠海馬或側(cè)腦室注射聚合狀A(yù) β可以在局部造成大量的Aβ沉積，同時可導(dǎo)致大鼠空間辨別能力、逃避反應(yīng)能力和學(xué)習(xí)記憶能力受損[1]。本實驗使用凝聚態(tài)Aβ(25-35)通過立體定位進行海馬注射，復(fù)制AD模型，由于注射 Aβ時伴有機械損傷，故實驗分組時設(shè)置了生理鹽水對照組。該肽段也是常用來制作模型的肽段之一。Chen等[2]的研究證明Aβ(25-35)注射入大鼠海馬CA1-3區(qū)所建立的AD模型在Morris水迷宮中與對照組相比表現(xiàn)出了更長的潛伏期和更長的游泳距離，說明其對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有著明顯影響，水迷宮可以有效地測量大鼠的空間辨別能力。本實驗中采用了Morris水迷宮來檢測建模的效果，以大鼠找到平臺所需時間為檢測學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)來衡量大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。建模7 d后，Aβ(25-35)組大鼠找到平臺的時間延長，提示建模成功。

自噬是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)和對不良環(huán)境的一種防御機制，參與清除細(xì)胞廢物、結(jié)構(gòu)重建和生長分化等，同時自噬又參與多種疾病的病理過程，無論是自噬過度還是不足都可導(dǎo)致疾病發(fā)生。自噬和凋亡雖是2種不同的程序性細(xì)胞死亡，但兩者的關(guān)系十分密切[3]。細(xì)胞凋亡和自噬性細(xì)胞死亡被稱為Ⅰ型和Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，在一定細(xì)胞環(huán)境或刺激物的作用下，兩者也可能是相互關(guān)聯(lián)的[4]。自噬可以作為始因誘導(dǎo)凋亡，抑制自噬會延緩凋亡的發(fā)生;過度的自噬可以激活自噬性細(xì)胞死亡，抑制自噬減弱自噬性細(xì)胞死亡。有研究發(fā)現(xiàn)特異性地抑制自噬可以延遲細(xì)胞凋亡，然而，特異性地抑制細(xì)胞凋亡卻不能影響自噬[5]，提示自噬可能是細(xì)胞凋亡的前提之一，自噬發(fā)生于細(xì)胞凋亡之前并進一步上調(diào)后者的活性。新近有研究發(fā)現(xiàn)，3-MA特異性地抑制自噬可以對抗Aβ引起的自噬性細(xì)胞死亡[6];自噬也可以拮抗凋亡，抑制自噬會增加細(xì)胞對凋亡信號的敏感性;自噬和凋亡還可以相互獨立，抑制任何一條信號途徑都會導(dǎo)致細(xì)胞進入另一種程序性細(xì)胞死亡。

那么，在阿爾茨海默病病理發(fā)生過程中，神經(jīng)元自噬和凋亡之間有什么關(guān)系呢?有研究顯示在阿爾茨海默病患者早期的病理檢查中發(fā)現(xiàn)自噬水平增加。本研究中用自噬特異性的抑制劑3-甲基腺嘌呤可以抑制Aβ(25-35)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬的發(fā)生，這也反向證明了自噬的存在。同時，Aβ(25-35)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬被抑制后，神經(jīng)細(xì)胞對Aβ(25-35)誘導(dǎo)的凋亡敏感性明顯增加。由此我們認(rèn)為Aβ(25-35)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡之間存在cross-talk，前者可以拮抗后者的發(fā)生。3-甲基腺嘌呤抑制自噬后可能增加了神經(jīng)細(xì)胞對凋亡信號的敏感性，從而促進了Aβ引起的細(xì)胞凋亡，這與Zheng等[7]的觀點一致。至于拮抗的原因還要依靠進一步分子機制的研究。

Beclin-1是自噬過程中一種重要的蛋白質(zhì)，是自噬啟動的標(biāo)志，也是自噬重要的正性調(diào)節(jié)因子[8]。Beclin-1還是參與自噬調(diào)控的重要基因，它可以通過提高細(xì)胞自噬來抑制凋亡，其不僅與自噬調(diào)控通路有關(guān)，而且涉及細(xì)胞凋亡的調(diào)控，可能同時參與2種程序性細(xì)胞死亡過程[9，10]。因此，本研究用beclin-1作為細(xì)胞發(fā)生自吞噬的標(biāo)志分子。本實驗Aβ(25-35)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬被抑制后，beclin-1蛋白表達(dá)較低。已有報道證實帕金森病模型大鼠用3-MA預(yù)處理，雙層膜包裹的自噬泡較少，beclin-1的表達(dá)下降[11]。而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素處理大鼠傷寒沙門菌所致巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常;beclin-1的表達(dá)量增加[12]。有報道beclin-1在AD病人的早期表達(dá)下降，在APP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，自噬可以調(diào)節(jié)在AD發(fā)病機制中起核心作用的Aβ的聚集[13，14]。提示在阿爾茨海默病的發(fā)生過程中自噬只是一個早期事件。

自噬在阿爾茨海默病中的作用及其信號通路尚未明了，本研究顯示神經(jīng)細(xì)胞自噬程度可導(dǎo)致凋亡變化，下一步將繼續(xù)深入探討在神經(jīng)退行性疾病中自噬作用的分子機制及其與細(xì)胞凋亡相互連接的信號通路，探索防治阿爾茨海默病的新途徑。

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