低氧－復氧對人鼻咽癌細胞增殖、細胞周期、黏附和侵襲能力的影響*

楊海峰， 朱林燕， 鄭廣娟， 陳麗新， 王立偉， 林 熙， 唐慰萍

(1廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東省中醫院病理科，廣東 廣州 510120;暨南大學醫學院2藥理學系，3生理學系，廣東 廣州 510632;4廣東醫學院病理學教研室，廣東 湛江 524023)

低氧是實體瘤微環境中一個重要的病理生理學特征。當實體瘤直徑達1－2 mm時，血液循環中的氧難以到達腫瘤中心導致腫瘤低氧(tumor hypoxia)［1］，而腫瘤新生血管的建立可使腫瘤低氧區域重新獲得氧的供應(reoxygenation)。因而腫瘤微環境表現為周期性的低氧 －復氧(hypoxia－reoxygenation，H－R)。研究顯示:H－R可誘導腫瘤細胞產生適應性變化，腫瘤基因組不穩定性增加，由此產生的新的腫瘤變異型甚至對低氧有更好的生存適應能力［2，3］。鼻咽癌是一種高發于我國南方地區的惡性腫瘤，其原發瘤及頸部淋巴結轉移瘤的微環境中都有低氧的表現。我們前期研究發現，低氧可誘導鼻咽癌細胞(CNE－2Z)血管內皮生長因子表達增加［4］，這一機制可能促進腫瘤血管生成，恢復腫瘤供氧。在此，我們通過研究CNE－2Z細胞在H－R后其增殖能力和細胞周期進程的改變，以及H－R對細胞黏附、侵襲和轉移能力的影響，探討微環境HR對鼻咽癌細胞生物學特性影響的規律。

材料和方法

1 細胞培養

低分化人鼻咽細胞株CNE－2Z(本室建株并保存)培養于含10%新生牛血清(Gibco)、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI－1640(Gibco)培養液中，預先在37℃、20%O2和5%CO2(常氧)環境中培養24 h使細胞進入對數生長期，更換新鮮培養液進行低氧和復氧實驗，并設立常氧對照組。低氧環境的建立參照文獻［4］:將細胞置于培養箱獨立的密閉小室，先輸入純氮(99.99%)30 min(流量5 L/min)以置換裝置內的殘余O2;然后輸入混合氣(95%N2、5%CO2和 ＜0.1%O2)30 min(流量 5 L/min)，使氣體達到平衡后減小混合氣流量為0.2 L/min，維持裝置內低氧狀態。

2 MTT法檢測細胞增殖

CNE－2Z細胞以5×106/L的密度接種到96孔培養板，每孔200 μL，細胞貼壁8 h(以此時點A值為測量基點)。在培養24 h(生長曲線第1 d)后開始低氧和復氧實驗，并設立常氧對照組，低氧處理時間為24 h(生長曲線第2 d)。低氧實驗處理結束后，更換新鮮培養液后在常氧條件下繼續復氧培養4 d(相當于生長曲線第3－6 d)。在上述每個時點分別加入MTT，培養 4 h，去培養液，加入 DMSO 100 μL/well，輕輕振蕩5 min后，全自動酶標儀測定570 nm波長的吸光度值。計算A比值(A比值=A570/8 h A570)，以A比值為縱座標，培養時間為橫座標，繪制細胞生長曲線。

3 流式細胞術測定細胞周期

CNE－2Z細胞進行低氧和復氧實驗，并設立常氧對照組，分別在低氧24 h(H組)、復氧8 h(H－R8組)和復氧24 h(H－R24組)時點收集細胞，碘化丙啶染色，流式細胞儀檢測細胞周期。

4 同質黏附實驗

分組:常氧組(N組)，低氧組(H組)，低氧復氧6 h(H－R6)，低氧復氧12 h組(H－R12)，低氧復氧24 h組(H－R24)。制備黏附系統:以4.0×104/well細胞密度接種于96孔培養板，置于5%CO2、21%O2、37℃環境中培養24 h，使細胞鋪滿孔底，不留空隙，更換新鮮培養液，分別予以分組中的不同處理因素。Trypsin－EDTA消化制備細胞懸液，以不含無血清的RPMI－1640洗滌1次。臺盼藍染色作活細胞計數，用無血清RPMI－1640稀釋，制備5.0×108/L的細胞懸液。細胞懸液按150 μL/well加入黏附系統，孵育4 h。以200 r/min振搖5 min。吸取培養孔中未黏附的細胞，臺盼藍染色計數，計算細胞同質黏附率:

5 細胞－基質黏附實驗

分組同上。制備黏附系統:Matrigel? (Becton Dickinson Labware)以無血清 RPMI－1640稀釋至100 mg/L后按50 μL/well加入96孔細胞培養板，置于超凈工作臺過夜風干。臨用前按100 μl/well加入無血清RPMI－1640培養液，室溫靜置90 min后吸去液體以去除未結合的Matrigel?。CNE－2Z細胞培養24 h至指數生長期，更換新鮮培養液，分別施加上述分組中的不同處理因素。Trypsin－EDTA消化制備細胞懸液，以不含小牛血清的RPMI－1640洗滌3次。臺盼藍染色作活細胞計數，用無血清RPMI－1640稀釋，制備4.0×108/L的細胞懸液，按100 μL/well加入黏附系統，置于5%CO2、37℃環境中孵育2 h;終止孵育，吸去未黏附細胞，加入100 μL/well結晶紫染液染色10 min;溫PBS洗滌4次，每次3 min;將培養板置于37℃干燥;加入醋酸－乙醇溶液100 μL/well，混勻后靜置10 min。酶標儀570 nm測定吸光度值。以吸光度值大小表示細胞－基質黏附力。

6 細胞體外侵襲實驗

在實驗前預先以稀釋的Matrigel?鋪入Transwell? (直徑6.5 mm，孔徑8.0 μm，Corning)制備體外細胞侵襲系統。

制備5×108/L的細胞懸液(H－R組細胞預先經過24 h低氧及隨后進行的24 h復氧處理)，按100 μL/well加入 Transwell?上室進行侵襲實驗24 h。常氧組(N)和低氧復氧組(H－R)實驗在常氧環境中進行，低氧組(H)實驗在低氧環境中進行。

實驗結束后，棄去孔內培養液，甲醇∶丙酮(1∶1)固定10 min。以濕潤的棉簽拭去聚碳酸酯濾膜正面(靠近上室面)的細胞。常規HE染色，中性樹膠封片。顯微鏡下計數穿越人工基底膜Matrigel?，到達聚碳酸酯濾膜至反面的細胞數，每個Transwell?計數濾膜中央的5個連續高倍視野，以每視野細胞平均數代表侵襲能力。每次實驗設重復孔，重復3次。

7 統計學處理

結 果

1 低氧對CNE－2Z細胞增殖的可逆性抑制作用

如圖1所示，與常氧對照組比較，低氧處理24 h(相當于生長曲線第2 d)后，A相對值較常氧對照組低，二者比較差異顯著(P＜0.01)。復氧培養24 h后(相當于生長曲線第3 d)A值較低氧處理結束時(第2 d)有所增加(P＜0.01)。在此之后(生長曲線第3－5 d)，與常氧對照組比較，低氧復氧組A值呈現快速升高的趨勢，表現為生長曲線坡度的顯著抬升，直至復氧后第5 d(生長曲線第6 d)，低氧復氧組A值與常氧對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 1.Effect of hypoxia－reoxygenation on growth curves of CNE－2Z cells..n=18.＊＊P＜0.01 vs normoxia.圖1 低氧－復氧對CNE－2Z細胞生長曲線的影響

2 低氧－復氧對CNE－2Z細胞周期的影響

如圖2和表1所示，H－R影響了細胞周期分布。低氧處理24 h，細胞G1期比例明顯增加，達到(73.6±2.7)%，與對照組 G1期比例［(62.6 ±4.6)%］相比，差異顯著(P＜0.01)。復氧8 h，G1期細胞比例顯著下降，而S期細胞比例顯著增加，與常氧對照組和低氧處理組比較差異顯著(P＜0.01)。復氧后24 h，細胞周期的分布已經恢復至接近正常對照組水平。流式細胞術測定H－R處理后未見明顯的凋亡峰，見圖2。

3 低氧－復氧對CNE－2Z細胞同質黏附能力的影響

低氧處理24 h后，CNE－2Z細胞同質黏附率為(24.17±10.39)%，低于常氧對照組的(47.99±7.41)%，差異顯著(P＜0.01)。復氧后同質黏附能力較低氧組有顯著增加，在復氧6、12 h同質黏附率分別為(46.68±9.08)%和(45.43±5.30)%，與低氧組比較差異均顯著(P＜0.01)，見圖3。然而與常氧對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 2.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell cycle of CNE －2Z cells.A:normoxia;B:hypoxia for 24 h;C:reoxygenation for 8 h;D:reoxygenation for 24 h.圖2 低氧－復氧對CNE－2Z細胞周期的影響

表1 低氧－復氧對CNE－2Z細胞系細胞周期分布的影響Table 1.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell cycle distribution of CNE－2Z cells()

表1 低氧－復氧對CNE－2Z細胞系細胞周期分布的影響Table 1.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell cycle distribution of CNE－2Z cells()

＊＊P ＜0.01 vs N;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs H.N:normoxia;H:hypoxia for 24 h;H－R8:reoxygenation for 8 h;H－R24:reoxygenation for 24 h.

N 8 62.6 ±4.6 12.4 ±3.1 25.0 ±4.1 H 3 73.6 ±2.7＊＊ 5.9 ±3.6＊＊ 20.8 ±5.8 H － R8 3 46.9 ±1.7＊＊## 9.1 ±1.6# 44.0 ±0.1＊＊##H － R24 4 60.6 ±3.3## 12.9 ±1.0## 26.6 ±2.6#

Figure 3.Effect of hypoxia－reoxygenation on homotypic adhesion of CNE－2Z cells..n=8.＊＊P＜0.01 vs normoxia，H－R6，H－R12 and H－R24.圖3 低氧－復氧對CNE－2Z細胞同質黏附力的影響

4 低氧－復氧對CNE－2Z細胞細胞－基質黏附能力的影響

如圖4所示，低氧處理組平均光密度值為0.943±0.055，稍低于常氧對照組0.973±0.042，但是二者比較無顯著差異(P＞0.05);復氧6、12、24 h組平均吸光度值分別為1.246±0.052、1.336±0.065和1.668±0.085，均高于常氧對照組，與常氧對照組比較差異顯著(P＜0.01)。復氧12 h組與復氧6 h組，復氧24 h組與復氧12 h組分別進行兩兩比較，差異顯著(P＜0.01)。

5 低氧－復氧對CNE－2Z細胞體外侵襲能力的影響

Transwell體外侵襲實驗顯示，低氧處理組侵襲細胞數為(33.8±2.7)個/HPF，常氧對照組侵襲細胞數為(51.6±3.3)個/HPF，H－R組侵襲細胞數為(62.5±3.0)個/HPF，方差分析顯示組間有顯著差異(n=6，P＜0.01)。

討 論

Figure 4.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell－matrix adhesion of CNE－2Z cells..n=15.＊＊P＜0.01 vs normoxia and hypoxia.圖4 低氧－復氧對CNE－2Z細胞－基質黏附力的影響

Figure 5.Effect of hypoxia on invasion ability of CNE－2Z cells in vitro..n=6.A:normoxia;B:hypoxia for 24 h;C:reoxygenation for 24 h.圖5 低氧對CNE－2Z細胞侵襲能力的影響

腫瘤組織低氧是腫瘤細胞快速生長以及腫瘤新生血管在結構和功能上紊亂的結果。在實體瘤中，腫瘤細胞的生長速度大于其營養血管的生長速度，受滲透能力的限制，遠離血管的腫瘤細胞無法得到充足的氧供應，表現為腫瘤低氧［1］。近年來低氧與腫瘤關系得到研究者的重視。一系列的研究表明，低氧可以改變腫瘤細胞低氧目的基因(hypoxia target genes)的表達［5－7］，臨床研究也證實腫瘤低氧與晚期頭頸癌癥患者的不良預后相關［8］。

有報道鼻咽癌原發瘤及頸部淋巴結轉移瘤微環境中都有低氧的表現，并且可能和腫瘤的分化以及腫瘤的體積增加有關［9，10］。治療前乏氧程度及其在治療中的變化與腫瘤的消退速度相關［11］。我們的前期研究表明:低氧可以誘導人鼻咽癌CNE－2Z細胞表達VEGF增加［4］，提示低氧可能對鼻咽癌細胞的演進產生影響。為進一步明確低氧對腫瘤細胞的影響，在本研究中，我們建立低氧和復氧處理的體外細胞培養模型，系統地研究低氧和復氧對鼻咽癌細胞生物學特性的影響。

我們的結果表明，低氧雖不利于鼻咽癌細胞生長，表現為細胞的增殖能力受抑制、細胞周期停滯在G1期及侵襲能力降低。然而復氧后細胞快速增殖，在復氧第5 d時A值已經與常氧對照組相比無顯著性差異。而且從生長曲線圖上可以看出，在復氧2－4 d時，H－R組曲線斜率大于常氧對照組，表明在此期間H－R組的鼻咽癌細胞的增殖速度超過常氧對照組。細胞周期研究顯示:復氧后8 h，原來在低氧環境中阻滯于G1期的CNE－2Z細胞順利通過了細胞周期的G1/S期限制點，同步化進入S期，到復氧24 h后，細胞周期的分布已經基本恢復到常氧對照組水平。此結果提示低氧導致鼻咽癌細胞的G1期阻滯，這可能是腫瘤細胞對不利環境產生的一種適應性變化，使鼻咽癌細胞的存活能力得以在低氧微環境保存;而復氧使鼻咽癌細胞CNE－2Z快速擺脫G1期阻滯，重新進入正常的細胞周期循環。

我們還發現，H－R可能賦于鼻咽癌細胞某些有利于腫瘤惡性演進的生物學特性。細胞黏附實驗結果顯示:低氧使鼻咽癌細胞同質黏附力降低;復氧后細胞－基質黏附力增加，且隨著復氧時間的延長表現出時間依賴模式。Transwell侵襲實驗結果顯示，復氧處理后，由于低氧而受到抑制的細胞侵襲能力得到恢復，并且較正常對照組有所升高。

侵襲是腫瘤轉移的重要環節，在轉移的連續性步驟中，腫瘤細胞侵入血管(intravasation)、侵出血管(extravasation)和植入(colonization)目標組織等重要步驟均與腫瘤細胞的侵襲能力相關［12］。低氧后復氧誘導的侵襲能力增加可能促進鼻咽癌細胞的侵襲和轉移的過程。細胞黏附也是影響腫瘤侵襲轉移的重要環節:瘤細胞與瘤細胞之間的黏附稱為同質黏附，同質黏附力降低有利于瘤細胞從原發瘤部位的分離，啟動侵襲和轉移的過程。另一方面，細胞－基質黏附能力的增加則有利于腫瘤細胞侵入新的組織器官，完成侵襲和轉移的過程［3］。因此，我們認為，低氧及復氧通過調節腫瘤細胞的黏附能力，可能促進鼻咽癌細胞侵襲和轉移。

綜上所述，在低氧和復氧條件下，鼻咽癌細胞經歷了一系列生物學特性的變化，這些變化不僅是為了在低氧微環境存活和生長，而且存在著腫瘤細胞對微環境變化的主動性適應過程。提示腫瘤微環境低氧一方面是腫瘤生長的不利因素，另一方面，低氧在腫瘤的發生發展過程中可能起到一種“信號”的作用，促使腫瘤細胞自覺改變一些生物學表型，為進一步的侵襲和轉移做準備，甚至主動性啟動腫瘤侵襲轉移過程。

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