血卟啉對人胰腺癌細胞Panc－1的光動力作用及機制*

于 鐘， 鐘 娃， 袁宇紅， 陳其奎， 朱兆華△， 張晉昕

(1中山大學孫逸仙紀念醫院消化科，廣東 廣州 510120;2中山大學醫學統計與流行病學系，廣東 廣州 510080)

迄今為止，胰腺癌仍是所有常見惡性腫瘤中生存率最低者，僅10%的患者在就診時有手術機會［1］，對無法手術的患者，可能有效的措施是化療、放療或二者的結合。目前總的1年生存率不超過10%［2］，新治療方法仍亟待解決。

光動力治療(photodynamic therapy，PDT)是二十世紀80年代發展起來的一種腫瘤治療新方法，其原理是利用光敏劑能夠選擇性聚集在腫瘤組織中，然后用特定波長的激光激發光敏劑，使其產生光化學和光生物學反應，破壞腫瘤組織［3］。本研究以人胰腺導管細胞癌Panc－1細胞系為對象，系統觀察了光敏劑Photosan(即血卟啉，hematoporphyrin)PDT對體外培養的人胰腺癌細胞的殺傷效應，并探討其主要作用機制。

材料和方法

1 主要試劑及儀器

人胰腺癌細胞系Panc－1購于美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)，并由我院醫學研究中心凍存。Photosan凍干粉針(145 mg/支，購自 SeeLab);CCK－8(Cell Counting Kit－8，日本同仁化學研究所);活性氧檢測試劑盒、細胞壞死與凋亡檢測試劑盒(均購自碧云天生物技術研究所);兔抗鼠活性caspase－3多克隆抗體(Abcam)。Biolitec PDT 630半導體激光治療儀(CeramOptec GmbH);流式細胞儀 (FACS Calibur，Becton Dickinson);組合式熒光壽命與穩態熒光光譜儀(英國愛丁堡儀器公司)。

2 人胰腺癌細胞株Panc－1的體外培養

參照司徒鎮強［4］介紹的方法進行。Panc－1細胞常規復蘇后在RPMI－1640完全培養基(含青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L、10%新鮮胎牛血清)中培養，細胞培養密度為(1－2)×109/L，每3－4 d傳代1次，取對數生長期用于實驗。

3 光敏劑Photosan溶液的準備

每于實驗前根據實驗所需稱取Photosan凍干粉，用不含血清的RPMI－1640培養基配制成不同濃度的溶液，保存于4℃備用。所有操作過程及保存均在避光條件下進行。

4 光敏劑Photosan對Panc－1細胞的PDT作用

4.1 PDT 配制光敏劑為如下濃度:0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 mg/L，并設不加光敏劑的空白對照(0 mg/L)。設光照劑量如下:1、5、10、15、20、25、30 J/cm2，并設不予照射的空白對照(0 J/cm2)。實驗設3個復孔。調整Panc－1細胞密度為5×107/L，接種于96孔板，每孔100 μL，培養24 h，使細胞貼壁。更換細胞培養基為上述各種濃度的光敏劑100 μL/well，培養8 h。再更換光敏劑溶液為不含血清的培養基100 μL/well，立即給予激光照射，波長630 nm、光斑直徑5 cm。為避免光線散射或反射的影響，每板只接受1次激光照射。照射完畢，所有96孔板繼續培養24 h。

4.2 PDT后CCK－8實驗測定Panc－1細胞活性(1)原理:CCK－8試劑中含有WST－8，它在電子載體1－methoxy PMS的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜染料。生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比，因此可以酶標儀檢測其吸光度進行細胞毒性分析［5］。(2)方法:取出所有96孔板，每孔加入10 μL的CCK－8，輕微振蕩混勻10 min，置培養箱孵育4 h后取出，以酶標儀檢測各組各孔吸光度值，每板用一空白孔調零。檢測波長為450 nm，參比波長為630 nm。各組吸光度(A450)可以轉換為細胞存活率(%):［(實驗孔A450－調零孔A450)/(對照孔A450－調零孔A450)］×100%。上述實驗重復3次，所有操作過程均在避光條件下進行。

5 光敏劑Photosan對Panc－1細胞PDT作用的機制

5.1 PDT后Panc－1細胞內活性氧(reactive oxidative species，ROS)的測定

①熒光顯微鏡觀察Panc－1細胞內活性氧 原理:熒光探針2’，7’－二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFHDA)可自由進入細胞，被細胞內的酯酶水解生成DCFH。細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，檢測DCF的熒光就可以反映細胞內活性氧的水平［6］。方法:配制光敏劑為如下濃度:1、4、8、10 mg/L，并設不加光敏劑的空白對照(0 mg/L)。光照劑量如下:1、5、10 J/cm2，并設不予照射的空白對照(0 J/cm2)。PDT治療同4.1。PDT后1 h用無血清培養基稀釋DCFH－DA為10 μmol/L，并更換各孔培養基，100 μL/well，置培養箱孵育30 min，用無血清培養基洗滌細胞3次，置于熒光顯微鏡下觀察并照片。根據說明書提供的DCF激發波長488 nm，發射波長525 nm，選擇藍色激發光，觀察綠色熒光。

②流式細胞儀測定Panc－1細胞內活性氧 光照劑量和光敏劑濃度的設置、PDT治療、裝載熒光探針DCFH－DA均同①。試驗中Panc－1細胞接種于12孔板，密度為1×108/L，1 mL/well。實驗完畢，收集各組各孔細胞，1000 r/min離心5 min，PBS洗滌、重懸后，以流式細胞儀測定DCF相對熒光強度。

5.2 流式細胞儀檢測PDT后Panc－1細胞凋亡及壞死 Panc－1細胞接種于直徑6 cm培養皿，一組照射功率5 J/cm2，光敏劑濃度為 0、2、4、6、8、10、12 mg/L;另一組光敏劑濃度 4 mg/L，照射功率為 0、5、15、20、25。PDT治療同上方法4.1，PDT后24 h收集各組細胞以流式細胞儀檢測各組細胞凋亡和壞死的比率。

5.3 Western blotting檢測 PDT后 Panc－1細胞caspase－3活性蛋白水平 細胞標本分組如下(包括不加光敏劑且不予照射的空白對照)，見表1。

表1 Western blotting實驗細胞標本分組Table 1.Cell sample groups of Western blotting test

接種細胞于直徑6 cm培養皿，PDT方法同上方法4.1，PDT后24 h收集各組細胞，以Western blotting檢測細胞caspase－3活性蛋白水平。將X光片用凝膠成像系統在白光下掃描后，應用Image－Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件進行吸光度分析。實驗重復3次。

6 統計學處理

結 果

1 光敏劑Photosan對Panc－1細胞的PDT效應及其影響因素

PDT后24 h CCK－8實驗測得調零孔A450為0，各實驗組及對照組的A450見表2。各孔的細胞存活率見圖1。

統計顯示，光敏劑濃度0.5－10 mg/L時，細胞存活率總體隨濃度增加而明顯下降;10 mg/L以上，細胞存活率不再顯著下降;光照劑量1－20 J/cm2時，細胞存活率總體隨劑量增加而明顯下降，20 J/cm2以上，細胞存活率不再顯著下降。單純給予光敏劑(0 J/cm2)或光照(0 mg/L)，細胞存活率均不受影響，見圖1。光敏劑濃度和光照劑量之間存在交互作用(P＜0.05)。進一步以交互參數進行統計推斷［7］:將代表此二因素交互作用的變量“光敏劑濃度×光照劑量”與A450進行線性回歸，得到回歸系數β=－0.421(P＜0.05)，表明二者之間為協同作用。

表2 人胰腺癌細胞株Panc－1經不同濃度光敏劑和不同劑量光照后的A450值Table 2.The A450values of Panc－1 cells treated with different concentrations of photosensitizer and different doses of light(.n=3)

表2 人胰腺癌細胞株Panc－1經不同濃度光敏劑和不同劑量光照后的A450值Table 2.The A450values of Panc－1 cells treated with different concentrations of photosensitizer and different doses of light(.n=3)

Photosan concentration(mg/L)Light dose(J/cm2)1.411 ±0.0200.5 1.401±0.040 1.341±0.130 1.330±0.090 1.207±0.130 1.109±0.030 1.108±0.030 1.066±0.030 1.065±0.04011.412±0.090 1.282±0.090 1.198±0.060 1.083±0.050 1.033±0.050 1.002±0.080 0.984±0.060 0.981±0.0402 1.419±0.080 1.254±0.040 1.125±0.090 0.924±0.090 0.995±0.070 0.902±0.070 0.944±0.040 0.924±0.06031.401±0.030 1.258±0.080 1.079±0.060 0.655±0.050 0.863±0.040 0.682±0.050 0.735±0.030 0.793±0.00041.354±0.040 1.200±0.060 0.932±0.100 0.532±0.050 0.562±0.060 0.549±0.040 0.403±0.040 0.438±0.03061.410±0.060 1.197±0.040 0.709±0.060 0.356±0.090 0.212±0.020 0.214±0.010 0.182±0.020 0.206±0.02081.388±0.040 1.110±0.050 0.404±0.040 0.149±0.010 0.121±0.010 0.118±0.010 0.108±0.010 0.118±0.01010 1.367±0.040 0.943±0.050 0.215±0.020 0.107±0.010 0.110±0.010 0.104±0.090 0.099±0.010 0.098±0.01012 1.393±0.050 0.931±0.070 0.164±0.010 0.107±0.020 0.124±0.030 0.124±0.030 0.102±0.0110 15 20 25 3001.415±0.020 1.413±0.020 1.411±0.010 1.409±0.020 1.409±0.020 1.416±0.030 1.415±0.0200150 0.096 ±0.010

Figure 1.Viability of Panc－1 cells treated with different concentrations of photosensitizer and different doses of light.圖1 人胰腺癌細胞株Panc－1經不同濃度光敏劑和不同劑量光照后的細胞存活率

2 光敏劑Photosan對人胰腺癌Panc－1細胞PDT作用的機制

2.1 PDT后Panc－1細胞內活性氧的測定

①熒光顯微鏡觀察Panc－1細胞內活性氧 隨光敏劑濃度以及光照劑量的增加，活性氧陽性細胞數量增加，且熒光強度相應增強，見圖2。

②流式細胞儀測定Panc－1細胞內活性氧 光照劑量為5 J/cm2時，各濃度組細胞內活性氧的相對熒光強度見圖3;光敏劑濃度為4 mg/L時，各光照劑量組細胞內活性氧的相對熒光強度見圖4。統計顯示，隨光敏劑濃度的增加，以及隨光照劑量的增加，細胞內活性氧均逐漸增多(P＜0.05)。

Figure 2.ROS production in Panc－1 cells after PDT(fluorescence microscope，×40).A:Photosan 0 mg/L，light dose 0 J/cm2(control);B:Photosan 4 mg/L，light dose 1 J/cm2;C:Photosan 8 mg/L，light dose 5 J/cm2;D:Photosan 10 mg/L，light dose 5 J/cm2.圖2 PDT后Panc－1細胞內活性氧陽性細胞數量

Figure 3.Impact of Photosan concentration on intracellular ROS production(light dose=5 J/cm2).圖3 光敏劑濃度對細胞內活性氧的影響

Figure 4.Impact of light dose on intracellular ROS(Photosan concentration=4 mg/L).圖4 光照劑量對細胞內活性氧的影響

2.2 流式細胞儀檢測PDT后Panc－1細胞凋亡及壞死 光照劑量為5 J/cm2時各濃度組的細胞凋亡率和壞死率，以及光敏劑濃度為4 mg/L時各光照劑量組的細胞凋亡率和壞死率見圖5、6。

Figure 5.Rates of apoptosis and necrosis in groups of Photosan concentration when light dose was 5 J/cm2.*P ＜0.05 vs necrosis group.圖5 光照劑量為5 J/cm2時各光敏劑濃度組的細胞凋亡率和壞死率

Figure 6.Rates of apoptosis and necrosis in groups of light dose when Photosan concentration was 4 mg/L.*P ＜0.05 vs necrosis group.圖6 光敏劑濃度為4 mg/L時各光照劑量組的細胞凋亡率和壞死率

統計顯示，當光照劑量恒定時，細胞凋亡率和壞死率均隨光敏劑濃度增加而增加;當光敏劑濃度恒定時，凋亡率和壞死率均隨光照劑量增加而增加，但兩種情況下均表現凋亡率＞壞死率(P＜0.05)，表明細胞的損傷以凋亡為主。

2.3 Western blotting檢測 PDT后 Panc－1細胞caspase－3活性蛋白水平 結果見圖7。PDT后與PDT前(1)比，caspase－3水平明顯增強。并且隨光敏劑濃度增加(2－6)、隨光照劑量增加(7、4、8)，caspase－3水平相應增強(P＜0.05)。

Figure 7.Expression of activated caspase－3 protein in Panc－1 cells after PDT detected by Western blotting.圖7 Western blotting檢測PDT后Panc－1細胞caspase－3蛋白表達

討 論

1 血卟啉光動力治療對人胰腺癌細胞Panc－1的效應及其影響因素

實驗結果結合統計分析顯示:光動力治療對Panc－1細胞具有明確的殺傷效應。但是，單純給予光敏劑或單純進行光照，則無PDT效應，說明光敏劑和特定波長的光照是光動力殺傷腫瘤細胞作用中缺一不可的重要因素，這符合光動力治療的基本特點［8］。同時也提示:光敏劑或相應波長的激光，并不具備獨立的生物學效應，正常組織單獨接觸時可能是安全的。

研究發現，隨著光敏劑濃度和光照劑量的增加，PDT對細胞殺傷作用相應增強，當光敏劑達到10 mg/L，光照劑量達到15 J/cm2時，這一作用趨向達到最大。對此的解釋是:(1)由于光敏劑濃度對PDT效應的影響是通過細胞內光敏劑含量產生的。而細胞內光敏劑含量取決于細胞對其的攝取和“排泄”［9］過程，在光敏劑濃度較低時，細胞對其攝取超過排泄，當濃度增加到一定程度，攝取與排泄達到動態平衡，這時表現出細胞內光敏劑的“飽和”現象。(2)另一個影響光敏劑效應的因素是熒光猝滅現象，這是指熒光物質分子與溶劑分子之間或其自身分子之間發生的相互作用導致熒光強度減弱或消失的現象［10］。由于Photosan中大卟啉環之間的堆疊作用(稱為π－π堆積)，將導致分子之間的熒光猝滅而削弱其光敏活性，并隨濃度增高而逐漸明顯［11］。(3)這也可能與細胞內參與結合與轉運光敏劑的受體已全部動員有關。光照劑量對PDT效應的影響則與其所引發光敏劑產生的光化學反應隨照射能量的逐漸增大最終達到“飽和”有關。

另外，結果還發現，光敏劑濃度與光照劑量之間存在交互作用。為進一步明確該交互作用的類型及其影響，我們進行了交互系數的統計推斷。當該系數β≠0時，表示存在光敏劑濃度和光照劑量之間的交互作用，而β的正負則表示交互作用對因變量的作用是增強還是減弱［7］。經計算得到β=－0.421，表明光敏劑濃度和關照劑量的交互作用是協同降低細胞存活率。這一現象的原因尚不清楚，但對臨床工作可能提供有意的指導。比如，為提高療效可以通過增加少許光照劑量而不必投入更多的光敏劑，從而減少大劑量光敏劑對皮膚光敏損傷等副作用的風險以及熒光猝滅現象的不利影響;而且增加光照劑量幾乎不需增加費用，但光敏劑的增加將顯著增加病人的經濟負擔。曾有學者認為光敏劑濃度和光照劑量之間并無明顯互惠作用，原因之一可能是光照對光敏劑的破壞而使其消耗，該現象稱為光漂白(photobleaching)［12］。而由于光漂白效應與光敏劑自身特性及其所處的體系有很大關系，因此尚需更多的研究來探討光漂白對光敏劑濃度和光照劑量之間關系的影響。

2 光敏劑Photosan對人胰腺癌Panc－1細胞PDT作用的機制

光動力對腫瘤的治療涉及非常復雜的光化學和光生物學反應，其機制至今尚不十分明確，但基本原理是腫瘤組織吸收光敏劑后，經特定波長的光照射，在生物組織中氧的參與下產生含氧自由基和/或單線態氧，ROS破壞腫瘤細胞［13］。本研究從上述各階段探討了光敏劑Photosan對人胰腺癌Panc－1細胞的作用機制。

2.1 PDT激發活性氧的產生 熒光顯微鏡和流式細胞術均檢測到PDT后Panc－1細胞內產生了活性氧，這符合光動力反應的基本規律，并且從定性和定量兩個方面均顯示，隨光敏劑濃度、光照劑量增加，活性氧的產生相應增多。這是由于提高光敏劑濃度增加了細胞內光化學反應的底物－光敏物質，而光照劑量的增強則使單位質量的底物吸收更多的能量，最終均通過能量傳遞使活性氧產生增多。這也必將導致最終對細胞表現出更強的殺傷效應。

2.2 PDT殺傷效應以誘導細胞凋亡為主 腫瘤細胞的破壞死亡分為凋亡和壞死，本研究結果顯示PDT后24 h細胞凋亡和壞死兩種形式都存在，并且與光敏劑濃度以及光照劑量呈正相關，但凋亡細胞的比例始終高于壞死比例，提示PDT對細胞的破壞以凋亡為主。

目前的研究認為，PDT可誘導腫瘤細胞凋亡，也可引起壞死，這取決于細胞的種類和PDT的劑量(包括光敏劑和光照劑量)。有學者［14］發現:當PDT劑量較小時，誘發細胞凋亡或壞死的刺激因素較弱，細胞凋亡起主要作用;而當刺激因素逐漸增強時，細胞逐漸過渡到以壞死為主。至今仍無一種統一的機制來解釋這種現象。

本研究認為，引起上述分歧的原因之一可能在于對凋亡細胞檢測時機的把握。根據本實驗的經驗，典型的凋亡特征往往出現在PDT后凋亡的早期或中期，此時細胞膜尚完整，不管是形態學還是熒光染色都容易確定凋亡的特征，若檢測時間過遲，細胞的凋亡已發展至接近甚至已經死亡，則很難與壞死鑒別。當PDT劑量較大時，強大的光動力作用使細胞很快就發生一系列生化和病理改變而死亡，如果不注意把握時機及時檢測，可能會造成細胞以壞死為主的假象。當然，這一問題仍待今后大量的研究予以進一步闡明。

2.3 Photosan誘導Panc－1細胞凋亡的機制初探PDT導致細胞發生凋亡的機制涉及不同的光敏劑在亞細胞內的定位、凋亡信號的觸發及其在細胞內的各種傳導途徑等極其復雜的諸多環節。本研究為初步探討Photosan對Panc－1細胞PDT后凋亡的現象及其可能機制，選擇了caspase－3作為研究目標，結果顯示隨光敏劑濃度以及光照劑量的增加，細胞內caspase－3水平相應增加，表明細胞凋亡的發生。

Caspase家族在誘導細胞凋亡的分子機制中起著關鍵作用，是多條凋亡通路的匯聚點，是執行凋亡的最終途徑。其中caspase－3被認為是凋亡的關鍵蛋白酶，一旦被激活，即發生下游的級聯反應，發生凋亡［15－17］。

綜上所述，我們認為被細胞吸收后分布于細胞膜或細胞器膜(如線粒體膜)等的光敏劑經PDT后產生各種活性氧成分，觸發了凋亡的外途徑和/或內途徑，通過信號轉導激活caspase－3，并且隨光敏劑和光照劑量的增加，使該蛋白酶的激活更加顯著。caspase－3的激活可以通過(1)酶解滅活凋亡抑制物，如Bcl－2等;(2)酶解細胞外基質及骨架蛋白，如角質蛋白等;(3)裂解DNA修復相關分子，如聚ADP核糖多聚酶等，最終使細胞的功能和形態發生變化而凋亡［18］。

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