TIMP－3在肝癌組織中的表達及其與腫瘤侵襲轉移的關系*

周 奇，王亞峰，周祥兵，梁力建，彭寶崗

(中山大學第一附屬醫院肝膽外科，廣東 廣州 510080)

金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是一組具有特異性抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)功能的活性因子。一些研究發現，TIMP－1及TIMP－2及其與基質金屬蛋白酶MMP－2，MMP－9等的表達失衡在肝癌的侵襲、轉移和復發過程中起重要作用[1－3]。但對TIMP－3在肝癌中的表達變化及其對肝癌的發生、轉移等的影響還少有報道。本研究以臨床收集的56例肝細胞癌患者，分別從腫瘤大小、腫瘤分化程度、肝外轉移、門脈轉移、淋巴轉移等因素分析TIMP－3的表達水平差異;并以收集的原位癌組織、門脈癌栓組織、淋巴轉移組織及正常肝組織標本為對象，分別利用RT－PCR法檢測TIMP－3 mRNA和Western blotting法檢測TIMP－3蛋白表達水平，結合臨床病理資料分析其臨床和病理意義，以期明確TIMP－3在肝細胞癌中的作用，并為臨床診斷治療提供依據。

資料和方法

1 研究對象

收集我院2009年10月－2010年10月間住院明確診斷的肝細胞癌患者56例;男44例，女12例，年齡30－73歲，平均年齡(49.5±10.5)歲;其中合并肝硬化者37例，Child分級:A級26例，B級30例;病理資料:腫瘤直徑≤5 cm者25例，＞5 cm者31例;按照Edmondson－Steiner標準，Ⅰ +Ⅱ級、Ⅲ+Ⅳ級分別有26例、30例;淋巴轉移者21例;肝外轉移者13例;門靜脈癌栓者12例。對照組30例，為我院同期因肝內膽管結石或肝臟非腫瘤性病變住院行手術治療的患者，其中男18例，女12例，年齡28－67歲，平均年齡(45.5±11.8)歲。

對其中手術的肝癌患者，術中獲得標本包括原位肝癌組織30例、淋巴結轉移灶30例、門脈癌栓組織30例。這30例中肝細胞癌組男24例，女6例，年齡32－71歲，平均年齡(49.11±13.14)歲;Child分級:A級13例，B級17例;肝細胞癌患者病理資料:腫瘤直徑≤5 cm者12例，＞5 cm者18例;按照Edmondson－Steiner標準，Ⅰ+Ⅱ級、Ⅲ+Ⅳ級分別有13例、17例。另取對照組中肝正常組織作為對照。

2 方法

2.1 取樣方法 所有患者術前晨間空腹采靜脈血2 mL，放入0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝劑0.1 mL的試管中，充分混勻，1500 r/min離心10 min，血漿貯存于－70℃分批檢測。手術組患者在術后標本離體時間少于15 min，無菌條件下切取1 cm×1 cm×1 cm大小組織，迅速放進液氮中，24 h后轉入－70℃冰箱中保存。

2.2 ELISA 試劑為ADI酶標試劑盒，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，每個樣本均設雙復孔。

2.3 RT －PCR DNA 分子量 marker:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ markers，λ DNA/HindⅢ markers均系上海索萊寶生物科技有限公司產品。Taq DNA聚合酶購自Promega。RNA提取試劑盒:Total RNA Extraction System購自Gibco－BRL。逆轉錄按Invitrogene試劑盒說明操作。TIMP－3 mRNA擴增特異引物序列為5’－GGA ATT CAT GAC CCC TTG GCT CGG G－3’和5’－GGA ATT CAG GGT CTG GCG CTC AGG G－3’[9]，擴增產物長度為 648 bp，內參照為 GAPDH 序列。反應體積含1×PCR buffer，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，0.15 μmol/L TIMP － 3 primers，0.1 μmol/L GAPDH primers，1U Taq DNA 聚合酶，DNA模板2 μL。PCR循環參數為:95℃預變性5 min;95℃ 1 min，61 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，32 個循環后，72℃延伸5min。擴增產物行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，UVP凝膠成像系統觀察并分析。用Image Tool圖像分析軟件分別測量TIMP－3和GAPDH的平均積分吸光度，用 TIMP－3/GAPDH的比值來表示TIMP－3 mRNA的表達量。

2.4 Western blotting 手術樣本立即置于－80℃凍存。實驗時每份樣本取組織25 mg，用預冷的PBS漂洗2次，加入100 μL預冷的細胞裂解液，充分研磨，0℃放置30 min，4℃、12000 r/min離心15 min，取上清備用。將樣品(50 μg)加入2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃變性3－5 min，順序加樣，行 SDSPAGE電泳(12%分離膠，5%積層膠)。電泳結束后，經半干轉膜儀(Bio－Rad)轉膜1 h，轉膜時電流限定5.5 mA/cm2膜。5%脫脂奶粉室溫孵育膜1 h后，加入工作濃度為1∶1000的TIMP－3單克隆抗體(Oncogene)，4℃孵育過夜。加Ⅱ抗(NEB)，室溫孵育膜1 h。化學發光、顯影、定影。用Image Tool圖像分析軟件測量平均積分吸光度。

3 統計學處理

數據用SPSS 16.0軟件處理，計量資料用均數±標準差()表示，采用方差分析和t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。

結 果

1 血漿TIMP－3水平變化

1.1 肝細胞癌患者血漿TIMP－3顯著低于對照組(77.48±9.54 vs 114.58±8.60)，P ＜0.05。

1.2 肝細胞癌患者血漿TIMP－3在低分化腫瘤組及肝外轉移組顯著低于高分化腫瘤組及無肝外轉移組(P＜0.05)，在腫瘤數目、腫瘤大小、包膜侵襲、淋巴轉移及門脈轉移組中無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

表1 肝細胞癌患者血漿TIMP－3水平與臨床病理的關系Table1.The relationship between plasma TIMP－3 level and clinicopathological features()

表1 肝細胞癌患者血漿TIMP－3水平與臨床病理的關系Table1.The relationship between plasma TIMP－3 level and clinicopathological features()

*P＜0.05 vs no extrahepatic metastasis;#P＜0.05 vs low differentiation(Ⅰ+Ⅱ).

Clinical－pathological features n TIMP－3(μg/L)Number＜2 35 81.42 ±7.54＞2 21 80.87 ±8.43 DifferentiationⅠ +Ⅱ 26 79.31±11.48Ⅲ +Ⅳ 30 61.17±10.09#Tumor size≤5 cm 25 76.88 ±12.09＞5 cm 31 77.68 ±9.59 Envelope Yes 37 75.49 ±10.73 No 19 76.58 ±10.46 Lymphatic metastasis Yes 21 76.24 ±9.85 No 35 79.40 ±11.14 Extrahepatic metastasis Yes 13 53.62 ±8.64*No 43 79.58 ±10.87 Portal vein invasion Yes 12 75.50 ±9.83 No 44 77.32 ±10.85

2 TIMP－3 mRNA表達變化

2.1 組織提取總RNA樣品的鑒定 從實驗樣本組織中提取的總RNA經電泳，可見明顯的28S、18S和5S條帶，且28S的亮度大約是18S的2倍，說明所提取的總RNA基本沒有降解，有較好的完整性。對RNA樣品進行紫外分光光度分析，A260/A280=1.9，表明RNA具有較高的純度，符合反轉錄要求。

2.2 肝細胞癌患者與對照組組織中TIMP－3 mRNA表達 TIMP－3和GAPDH RT－PCR電泳結果見圖1，可見648 bp處出現一條帶，癌組織、門脈癌栓組織、淋巴轉移組織及正常肝組織均有表達，其中正常組織表達最為明顯。

Figure1.Results of TIMP－3 RT－PCR product electrophoresis.M:DNA marker;Lane 1，6，10，14:hepatocellular carcinoma(HCC)in situ;Lane 3，8，12，15:portal vein tumor emboli;Lane 4，7，9，13:normal liver tissues;Lane 2，5，11:lymphatic metastasis.圖1 TIMP－3 RT－PCR電泳結果

2.3 肝細胞癌患者與對照組組織中TIMP－3 mRNA陽性率比較 原位癌組織、門脈癌栓組織、淋巴轉移組織和對照組中 TIMP－3 mRNA陽性率分別為60.00%(18/30)%、36.67%(11/30)、33.33%(10/30)和83.33%(25/30)。對照組正常肝組織中TIMP－3 mRNA陽性率顯著高于原位癌組織(P＜0.05)、門脈癌栓組織(P＜0.01)和淋巴轉移組織(P＜0.01);原位癌組織中TIMP－3 mRNA陽性率顯著高于門脈癌栓組織(P＜0.05)和淋巴轉移組織(P＜0.05);TIMP－3 mRNA陽性率在門脈癌栓組織和淋巴轉移組織間比較無顯著差異(P＞0.05)。

2.4 肝細胞癌患者與對照組組織中TIMP－3 mRNA相對表達強度定量分析 正常肝組織、原位肝癌組織、門脈癌栓組織和淋巴轉移組織中TIMP－3 mRNA相對表達量分別為0.78±0.09、0.52±0.09、0.42±0.07和0.40±0.08。對照組正常肝組織中TIMP－3 mRNA相對表達強度顯著高于原位肝癌組織(P＜0.01)、門脈癌栓組織(P＜0.01)及淋巴轉移組織(P＜0.01);原位癌組織中TIMP－3 mRNA相對表達強度顯著高于門脈癌栓組織(P＜0.01)和淋巴轉移組織(P＜0.01);而淋巴組織和門脈癌栓組織相比無顯著差異(P＞0.05)。

Figure2.Expression levels of TIMP－3 mRNA..n=30.＊＊P ＜0.01 vs normal liver tissues.圖2 TIMP－3 mRNA相對表達水平變化

2.5 肝細胞癌患者TIMP－3 mRNA相對表達強度與臨床病理特征的關系 肝細胞癌患者TIMP－3 mRNA表達強度在低分化腫瘤組及侵襲轉移組中顯著低于高分化腫瘤組及無侵襲轉移組(P＜0.05)。其表達強度在性別、AFP、HBsAg、是否合并肝硬化、腫瘤大小和癌灶數目均無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

表2 肝細胞癌組織中TIMP－3 mRNA和蛋白相對表達強度與臨床病理特征的關系Table2.The expression of mRNA and protein of TIMP－3 and clinicopathological features(.n=30)

表2 肝細胞癌組織中TIMP－3 mRNA和蛋白相對表達強度與臨床病理特征的關系Table2.The expression of mRNA and protein of TIMP－3 and clinicopathological features(.n=30)

*P＜0.05 vs no extrahepatic metastasis;#P＜0.05 vs low differentiation(Ⅰ+Ⅱ).

Clinic－pathological features mRNA Protein Number＜2 0.43 ±0.31 76.89 ±9.04≥2 0.48 ±0.25 77.78 ±8.14 DifferentiationⅠ +Ⅱ 0.67 ±0.02 77.31 ±10.28Ⅲ +Ⅳ 0.43 ±0.28# 62.13 ±10.09#Tumor size≤5 cm 0.63 ±0.26 77.43 ±11.04＞5 cm 0.57 ±0.06 75.32 ±10.59 Lymphatic metastasis Yes 0.47 ±0.26 77.43 ±9.85 No 0.54 ±0.22 79.51 ±11.14 Extrahepatic metastasis Yes 0.48 ±0.22* 56.58 ±10.87*No 0.71 ±0.62 81.43 ±9.32 Portal vein invasion Yes 0.39 ±0.15 76.42 ±10.45 No 0.47 ±0.22 78.30 ±9.83

3 TIMP－3蛋白表達變化

3.1 肝細胞癌患者與對照組組織中TIMP－3蛋白檢測結果，可見24 kD處出現一條帶，原位癌組織、門脈癌栓組織、淋巴轉移組織及正常肝組織均有表達，見圖3。

Figure3.Results of TIMP－3 protein expression examined by Western blotting.Lane 1，3:HCC in situ;Lane 5，6:portal vein tumor emboli;Lane 2，4:normal liver tissues;Lane 7:lymphatic metastasis.圖3 Western blotting檢測 TIMP－3蛋白表達

3.2 肝細胞癌患者與對照組組織中TIMP－3蛋白陽性率比較 原位肝癌組織、門脈癌栓組織、淋巴轉移組織及正常對照組分別為63.33%(19/30)、40.00%(12/30)、36.67%(11/30)、86.67%(26/30)。對照組正常肝組織中TIMP－3蛋白陽性率顯著高于原位肝癌組織(χ2=4.36，P＜0.05)、門脈癌栓組織(χ2=14.07，P＜0.01)和淋巴轉移組織(χ2=15.86，P＜0.01);原位肝癌組織顯著高于門脈癌栓組織(χ2=4.27，P＜0.05)及淋巴轉移組織(χ2=4.16，P＜0.05);而門脈癌栓組織中TIMP－3蛋白與淋巴轉移組織比較無顯著差異(χ2=1.566，P＞0.05)。

3.3 肝細胞癌患者與對照組組織中TIMP－3蛋白相對表達強度定量分析 正常肝組織、原位肝細胞癌組織、門脈癌栓組織和淋巴轉移組織TIMP－3蛋白的平均積分吸光度分別為115.08±8.60、77.04±8.83、64.43±3.80和62.80±3.73。對照正常肝組織中TIMP－3蛋白相對表達強度顯著高于原位肝癌組織(P＜0.01)、門脈癌栓組織(P＜0.01)及淋巴轉移組織(P＜0.01);原位癌組織中TIMP－3蛋白相對表達強度顯著高于門脈癌栓組織(P＜0.01)和淋巴轉移組織(P＜0.01);而淋巴組織和門脈癌栓組織相比無顯著差異(P＞0.05)。見圖4。

Figure4.Expression levels of TIMP－3 protein..n=30.＊＊P ＜0.01 vs normal liver tissues.圖4 TIMP－3蛋白相對表達水平變化

3.4 TIMP－3蛋白相對表達強度與臨床病理特征的關系 肝細胞癌患者TIMP－3蛋白表達強度在低分化腫瘤組及侵襲轉移組明顯低于高分化腫瘤組及無侵襲轉移組(P＜0.05)，其表達強度與性別、AFP、HBsAg、是否合并肝硬化、腫瘤大小和癌灶數目均無關(P＞0.05)，見表2。

討 論

基質金屬蛋白(水解)酶(MMP)是一組由11種酶組成的內蛋白酶家族，它可以清除膠原分子、明膠分子等一些生物大分子，可以降解膠原蛋白以及蛋白多糖，為新細胞的生長提供空間[4]。

金屬蛋白酶組織抑制因子3(TIMP－3)是TIMP家族中特殊的一員，它屬于非可溶性蛋白，只存在于細胞外基質中的。研究表明，TIMP－3除了發揮抑制MMPs功能的作用外，還可刺激細胞增殖及誘導細胞凋亡，抑制腫瘤的生長、侵襲和轉移的作用[5－8]。本研究發現，與正常肝組織相比，肝細胞癌患者原位癌組織的TIMP－3表達水平下降，在門脈及淋巴等處的轉移瘤組織中，TIMP－3的表達水平更低甚至缺如。這提示TIMP－3的表達下調與肝癌的轉移高度相關。

在多種腫瘤細胞的研究中均發現存在著TIMP－3 表達的下調或丟失[9－12]，而恢復其表達可以降低腫瘤細胞的侵襲、轉移能力。如Ahonen等[12]通過腺病毒介導將TIMP－3基因轉染至黑色素瘤細胞系SK－Mel－5和A2058，結果發現，轉染陽性細胞對基底膜的侵襲能力明顯降低，同時對Ⅰ、Ⅳ型膠原和纖連蛋白的粘附性下降。有關研究發現，TIMP－3高表達可以顯著抑制宮頸癌細胞、頭頸部鱗癌細胞以及肝癌細胞在體外對基底膜的侵襲，阻止腫瘤進行性發展[13－15]。Castagnino 等[16]的實驗表明，上調TIMP－3可改善體外培養的平滑肌肉瘤細胞的分化程度，使腫瘤細胞的惡性表型減少，同時其生長速度及對基質的侵襲性均降低;而下調TIMP－3則會使該腫瘤細胞的增殖能力和對基質的侵襲性增強。這些資料均表明，TIMP－3可能是一種腫瘤抑制因子。但上述研究多為體外實驗結果，本研究結果表明肝細胞癌患者血漿TIMP－3表達顯著低于對照組，RT－PCR和Western blotting檢測證實肝細胞癌患者的門脈癌栓組織和淋巴轉移組織中TIMP－3 mRNA和蛋白陽性率及相對表達水平均明顯低于原位癌組織和正常對照組，從血漿蛋白及組織基因水平兩個方面說明TIMP－3的低表達可能促進了肝癌的侵襲和轉移。

腫瘤細胞中TIMP－3表達水平降低的分子機制目前尚無明確的結論。有報道認為TIMP－3啟動子的甲基化是其表達下降的原因。DNA甲基化是腫瘤組織常見的一種DNA修飾現象，與腫瘤組織的分化程度密切相關。本研究通過比較不同病理分化級別的肝癌組織中TIMP－3的表達水平，發現TIMP－3表達水平在分化程度比較低的腫瘤組織中明顯降低，也支持上述觀點。

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