TRAF6在人PBMC來源的樹突狀細胞成熟中的作用*

劉 璐，李 琳，閔 軍，王 捷，伍 衡，曾育杰，陳 雙，褚忠華△

(中山大學孫逸仙紀念醫院1胃腸外科，2婦產科，3肝膽外科，廣東 廣州 510120)

腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor－receptor associated factor，TRAF)是腫瘤壞死因子超家族和Toll樣/白細胞介素－1受體(interleukin－1 receptor，IL－1R)超家族重要的接頭分子，在天然免疫和獲得性免疫中發揮了重要的作用[1]。作為細胞質中重要接頭分子，TRAF6是TRAF家族中唯一能與IL－1R相關激酶、CD40等直接結合的信號分子。上述細胞因子通過TRAF6介導，調節下游信號通路，進而調節細胞的增殖及凋亡[2]。最近研究發現，TRAF6是介導樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)成熟信號轉導，促進DCs發育、激活與成熟的關鍵因子[3]。本實驗通過觀察TRAF6在不同成熟程度DCs的表達，進一步研究TRAF6在DCs誘導T細胞免疫中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 RPMI－1640干粉、L－glutamine、青霉素－鏈霉素(P－S)雙抗(Gibco);胎牛血清(fetal calf serum，FCS)(杭州四季青);Ficoll淋巴細胞分離液(相對密度1.077 g/L)(Lymphoprep);重組人粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophage colony－stimulating factor，rhGM－CSF)、重組人白細胞介素4(interleukin－4，IL－4)、腫瘤壞死因子－α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)、重組人白細胞介素 －6(IL－6)、重組人白細胞介素－1β(IL－1β)(PeproTech);藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記小鼠抗人CD83與HLADR、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記小鼠抗人CD86、CD80熒光單克隆抗體(Pharmingen);前列腺素 E2(prostaglandin－E2，PGE2)(Cayman);脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma);活細胞熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluoroscein succinimidylester，CFSE)(Molecular Probes);抗人 TRAF6抗體(Abcam);辣根過氧化物酶標記的鼠抗雞Ⅱ抗(Santa Cruz);人IL－12 p40 ELISA檢測試劑盒 (Diclone);Trizol Reagent(Gibco);DL 2000 DNA marker(TaKa-Ra);real－time PCR儀(Roche);UVP－GDS800紫外成像分析系統(UVI)。

1.2 人外周血樣品 取自我校身體健康的大學生志愿捐獻者，共5份，每份100 mL，均在獻血后2 h內進行外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)分離。

2 方法

2.1 DCs的培養與誘導成熟 用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，PBS洗滌2次，用RPMI－1640完全培養基(含10%滅活胎牛血清，2 mmol/L L－谷氨酰胺，1×105U/L P－S雙抗)將PBMC密度調到5×109/L，加入25 cm2培養瓶，37 ℃、5%CO2培養2 h，洗去非貼壁細胞保存備用。貼壁細胞用含1×106U/L rhGM－CSF和5×105U/L人重組IL－4的RPMI－1640完全培養基培養，第3 d加入新培養基及rhGM－CSF和IL－4。第6 d時收獲未成熟DCs，按1×109/L濃度接種24孔板，每孔體積1 mL，繼續用rhGM－CSF和IL－4培養，并分組誘導DCs成熟。A組:對照組，僅用rhGM－CSF和IL－4培養;B組:TNF－α誘導組，加入1×106U/L人TNF－α;C組:LPS誘導組，加入LPS 1 mg/L;D組:雞尾酒法(Cocktail)誘導組，加入細胞因子組合(1×106U/L TNF － α，10 μg/L IL － 6，10 μg/L IL － 1β，1 mg/L PGE2)誘導成熟。各組均在誘導24 h后收獲DCs，流式細胞儀進行細胞表型分析，并提取各組RNA。同時收集培養上清，－80℃保存，用于檢測IL－12 p40含量。

2.2 DCs表面標志的流式細胞儀分析 用直接免疫熒光標記法標記DCs，FACS Calibur流式細胞儀(B－D)上檢測成熟表型 CD80、CD83、CD86、HLA －DR，CellQuest軟件分析。每個樣品都用熒光標記同型IgG作為相應的陰性對照。

2.3 Western blotting檢測TRAF6蛋白的表達 分別收集第7 d各組DCs(1×106/L)，考馬斯亮藍檢測蛋白濃度后，以10%SDS－PAGE電泳分離樣品。電泳完畢后轉膜至PVDF膜，然后使用含5%脫脂奶的TBST進行封閉。加入雞抗人TRAF6多克隆抗體后4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的鼠抗雞Ⅱ抗常溫孵育1 h。加底物TMB顯色。

2.4 實時熒光定量 PCR(real－time PCR)檢測TRAF6 mRNA表達 以GAPDH作為內參照，TRAF6上游引物5’－AGGAATGTAGCAGCGATGGAA－3’，下 游 引 物 5’ － AGCCCAAGAAAGTACAACAAAGAG－3’，擴增產物217 bp(由上海博亞合成)。DNase I消化基因組 DNA后，逆轉錄合成cDNA，進行real－time PCR反應。反應條件:95℃變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s共40 個循環，76℃ 5 s檢測熒光，75℃到95℃做融解曲線。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增情況，結果以TRAF6 mRNA在不同誘導成熟組與對照組表達量的差異倍數表示。

2.5 ELISA法檢測DCs的IL－12分泌 采用雙抗體夾心法檢測IL－12 p40的含量，操作步驟按產品說明書進行，顯色后即刻用Wellscan MK3酶標儀檢測450 nm波長的吸光度(absorbance，A)值，根據標準曲線確定IL－12的含量，最小可測人IL－12 p40為20 ng/L。

2.6 混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)

①刺激細胞的獲取和處理 DCs培養的第7 d分別收集各組DCs，加入絲裂霉素C混和(終濃度為25 mg/L)，37℃避光水浴30 min后，PBS離心洗滌3次，重懸細胞。

②應答細胞的獲取和處理 收集2 h非貼壁的同種異體淋巴細胞，以PBS洗滌2次后加入CFSE 2.5 μmol/L染液使細胞濃度為1×1010/L。置于37℃水浴15 min，每5 min搖動1次。用RPMI－1640完全培養基中止染色，離心后重懸細胞。

③混合淋巴細胞培養 將上述刺激細胞和應答細胞按1∶10混合，以200 μL/well種至96孔 U形底細胞培養板，并設只有反應細胞的孔為對照。于37℃、5%CO2條件下培養。混合培養96 h后，收集細胞并洗滌后，送流式分析。在前散射(forward light scatter，FSC)和對側散射(side light scatter，SSC)二維散點圖中劃出淋巴細胞區R，分別對每個組別這群細胞的 FL1強度進行檢測，獲得的數據用CellQuest軟件和ModFit軟件分析。

3 統計學處理

采用SPSS 15.0統計軟件進行數據分析。數據以均數±標準差()表示，計數資料組間比較采用單因素方差分析。

結 果

1 各組DCs表面標志的變化

通過對第7 d后各組DCs流式檢測，B、C、D組反映成熟指標的細胞表型CD80、CD83、HLA－DR均明顯提高，與對照組(A組)比較差異顯著(P＜0.05)，其中CD83升高最為顯著(P＜0.01)。成熟表型表達最好的是雞尾酒法組，各成熟指標均高于B、C組，其中CD83指數高達84.87%，說明雞尾酒法誘導的DCs成熟度最佳，見圖1。

Figure1.The phenotype comparison of DCs among different groups..n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.圖1 各組DCs的細胞表型比較

2 Western blotting檢測結果

檢測培養6 d后加不同因子誘導24 h后各誘導組DC TRAF6蛋白的表達水平，B、C、D組較對照組TRAF6蛋白的表達升高，其中雞尾酒法組TRAF6蛋白的表達量最高，見圖2A。B、C、D組TRAF6蛋白的表達為(0.87±0.06，0.78±0.09，1.61±0.22)，與對照組(0.44±0.08)比較差異顯著(P＜0.05)。并且B組TRAF6蛋白的表達與C、D組比較差異顯著(P ＜0.05)，見圖2B。

Figure2.The expression of TRAF6 protein in different groups with Western blotting assay..n=5.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖2 Western blotting檢測各組DCs TRAF6蛋白表達

3 Real－time PCR檢測各組DCs TRAF6 mRNA表達水平

圖3為real－time PCR定量曲線?？梢姰擯CR反應進入對數增長期時，在同一個PCR循環期內雞尾酒組擴增的TRAF6 mRNA實時熒光強度顯著高于其它各組，說明雞尾酒組TRAF6 mRNA擴增起始濃度高于其它各組。進一步分析看到，D組TRAF6 mRNA表達量的差異倍數(2.99±0.39)與 B組(1.01±0.34)、C組(1.37±0.20)比較差異顯著(P＜0.01)。

4 各組DCs IL－12分泌量變化

Figure3.The real－time PCR amplification curves of TRAF6 mRNA in different groups.圖3 各組DCs TRAF6 mRNA的擴增曲線圖

采用雙抗體夾心ELISA法檢測各組DCs 24 h IL－12 p40分泌量，以1×106個DCs在1 mL培養液中的IL－12p40濃度表示。B、C、D組IL－12p40分泌量[(311.95±32.60)μg/L、(409.13±20.99)μg/L、(656.18±38.52)μg/L]與對照組[(142.72±21.65)μg/L]比較差異顯著(P ＜0.05)，見圖4。其中雞尾酒誘導下DCs IL－12 p40分泌量顯著高于B、C組(P＜0.05)。

Figure4.The IL－12 production in different groups..n=5.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖4 各組DCs IL－12的分泌量

5 各組DCs的MLR變化

由于成熟DCs高表達共刺激分子，有較強的刺激T淋巴細胞活化增殖的能力。我們使用CFSE熒光標記淋巴細胞，當淋巴細胞分裂時，CFSE標記的熒光可平均分配至兩個子代細胞中。因此在一個增殖的細胞群中，各連續子代細胞的熒光強度呈對半遞減。通過CFSE法可以檢測DCs對CFSE標記的淋巴細胞的刺激增殖能力，并以增殖淋巴細胞的子代占母代的比率表示。B、C、D組誘導的DCs的淋巴細胞刺激能力與對照組比較差異顯著(P＜0.05)，見圖5。而雞尾酒誘導下DCs對淋巴細胞刺激能力顯著高于B、C組(P＜0.05)，結果也與其DCs成熟程度與共刺激分子高表達相符合。

Figure5.Mixed leukocyte reaction..n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.圖5 混合淋巴細胞反應

討 論

研究發現，TRAF6是TRAF家族中唯一同時參與TNFR和IL－1R/TLR兩個受體超家族信號轉導的成員，介導不同受體轉導的激活NF－κB的信號(包括IL－1、TLRs和CD40)，成為多種信號傳遞與相互作用的樞紐[4]。TRAF6具有獨特的受體結合特異性，對于受體的識別與其它成員有明顯的結構差異。IL－1R/TLRs一旦與配體結合，即通過它們的共同接頭蛋白MyD88或類MyD88接頭蛋白Mal，經TRAF6介導NF－κB的激活與移位，啟動信號轉導途徑[5];而TNFR超家族成員如CD40和RANK則直接通過TRAF6激活NF－κB。此外，TRAF6在IL－25R介導的NF－κB激活與表達中起重要作用[6]。NF－κB的激活參與DCs啟動成熟過程，包括增加共刺激分子CD80、CD86表達和促進炎癥因子的釋放。

DCs作為功能最強的專職抗原遞呈細胞，在調節機體免疫反應中起核心作用。成熟DCs高表達MHC抗原肽和共刺激分子，具有刺激淋巴細胞增殖和激發免疫反應的能力。我們結果顯示在不同因子誘導的成熟DCs中，雞尾酒法誘導的DCs各項成熟表型指標最佳，特別是成熟 DCs的特征性標志CD83，其指數達到84.87。蛋白質印記檢測各成熟誘導組DCs TRAF6蛋白表達均升高。為進一步準確定量不同成熟度DCs的TRAF6 mRNA的表達，我們采用real－time PCR了解各組TRAF6 mRNA的表達差異，結果顯示隨著DCs成熟度的不同，TRAF6 mRNA表達有明顯的變化。TRAF6 mRNA表達越強則DCs的成熟度越高。說明TRAF6可能通過促進激活NF－κB上調DCs表面MHC抗原肽和共刺激分子進而誘導DCs成熟。Megas等[4]發現TRAF6基因缺失可影響細胞內NF－κB的激活。而Kobayashi等[3]研究發現TRAF6基因缺失，DCs不能上調MHC抗原肽和CD86分子表達，進一步證明TRAF6在上調DCs表面分子方面發揮了重要的作用。

DCs通過攝取、加工處理和遞呈抗原，誘導T細胞分化。MLR結果顯示TRAF6表達最高的雞尾酒法誘導DCs刺激T細胞增殖能力最強。而TRAF6基因缺陷的DCs誘導T細胞增殖能力減弱[3]，因為T細胞的完全激活需要多種信號的刺激，MHC抗原肽(第一信號)和共刺激分子CD80(第二信號)對在誘導T細胞分化過程中發揮了重要的作用[7，8]。因此DCs誘導T細胞分化能力與其表面分子的上調有密切關系。

成熟DCs通過分泌IL－12，可刺激淋巴細胞增殖。我們的結果顯示TRAF6表達越高，IL－12的分泌量越大。LPS等刺激因子與細胞表面TLR結合，通過蛋白MyD88激活白細胞介素－1受體相關激酶(interleukin －1 receptor－ associated kinase，IRAK)，TRAF6在此過程中發揮了重要的作用。而MyD88蛋白則是誘導DCs分泌IL－12的重要因素[3]，并且IL－12是誘導Th細胞向Th1細胞分化的關鍵因素[9，10]，可促進 T 細胞增殖、分化。

綜上所述，TRAF6的表達與DCs的成熟程度有密切的關系，TRAF6是調節DCs成熟、分化和激活的關鍵因素。特異性干預TRAF6的表達，可望有效抑制DCs的成熟。

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