黃芪多糖對早期糖尿病腎病大鼠足細胞nephrin和podocin表達的影響*

李志杰，張 悅，劉煜敏，陸海英，李亞麗，張 燕

(上海中醫藥大學1科技實驗中心，2基礎醫學院，3護理學院，上海 201203)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)又稱糖尿病腎小球硬化癥，其特點主要以腎小球血管受損、硬化為主，臨床上表現為尿蛋白排泄量增加[1]。大量研究表明，腎小球臟層上皮細胞即足細胞損傷是形成DN蛋白尿的關鍵因素[2，3]。而維持足細胞結構和功能的主要裂孔隔膜蛋白分子(nephrin和podocin)表達改變是足細胞損傷的重要標志。黃芪多糖(Astragalus polysaccharin，APS)是從補氣中藥黃芪中提取的有效成分。臨床與實驗證明黃芪多糖可以通過多條途徑對DN發揮治療作用[4，5]，但是通過穩定足細胞標志蛋白nephrin和podocin的表達而發揮保護作用未見報道。本研究旨在通過觀察nephrin和podocin在DN大鼠腎小球足細胞中表達的變化，探討黃芪多糖對DN腎臟的保護作用及機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康SPF級雄性SD大鼠24只，體重(220±20)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物許可證號為SCXK(滬)2007－0005。

1.2 藥物與試劑 黃芪多糖購于森馨生物，純度70%。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購于 Sigma，批號為119K1591。山羊抗兔nephrin抗體、山羊抗兔podocin抗體購于Abcam。小鼠來源GAPDH(甘油醛－3－磷酸脫氫酶)購于上?？党晒尽RP標記的山羊抗小鼠Ⅱ抗、HRP標記的山羊抗兔Ⅱ抗購于晶美生物工程有限公司。PVDF膜購于Millipore。其它試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器 強生穩步型血糖測試儀(強生中國有限公司)，酶標儀(BioTek PowerWave XS2)，電泳裝置(Bio－Rad)，倒置熒光顯微鏡(Olympus CKX41)，全自動熒光成像系統(HR 16)。

2 方法

2.1 糖尿病腎病模型的制備和分組 動物適應性喂養1周后，禁食12 h，按60 mg·kg－1對造模大鼠(16只)行一次性腹腔注射STZ(0.1 mol·L－1檸檬酸鹽緩沖液，pH 4.5，新鮮配制)。正常對照組(8只)大鼠注射等量檸檬酸鹽緩沖液。各組大鼠給予標準飲食喂養，自由飲水。1周后尾靜脈取血，空腹血糖≥16.7 mmol·L－1為糖尿病大鼠。將成模大鼠隨機分為STZ組(8只)和STZ+APS組(8只)。黃芪多糖按 400 mg·kg－1·d－1灌服，連續 8 周。正常對照組、STZ組灌服等量生理鹽水。

2.2 標本收集 在實驗結束前1 d代謝籠收集24 h尿液并記錄24 h尿量。大鼠處理前稱重，以20%烏拉坦1.5 g·kg－1的劑量腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分離血清，－20℃保存。取雙側腎臟，用濾紙吸干腎表面血液后稱重，取部分腎組織固定于甲醛中用于石蠟切片;其余腎組織置液氮中冷凍后以－80℃冰箱保存備用。

3 測定的指標

3.1 一般情況觀察 觀察大鼠精神狀態、活動狀況、毛發及體重、排便情況。

3.2 腎指數的測定 將大鼠麻醉后處死，迅速剖腹取兩側腎，用濾紙吸干腎表面血液后稱重。腎指數=兩側腎重量和(g)/體重量(kg)×100%。

3.3 血糖 分別于黃芪多糖干預后第2、5、8周尾靜脈取血檢測血糖。

3.4 各組大鼠24 h尿蛋白總量的測定 按照試劑盒說明書(BBC法)步驟測定24 h尿蛋白總量。

3.5 血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，SCr)的測定 血清尿素氮、血清肌酐按試劑盒說明書分別采用脲酶法和苦味酸法(除蛋白)檢測。

3.6 腎臟病理檢查 取腎皮質，10%甲醛固定，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、制成3 μm石蠟切片，HE染色后光鏡觀察。

3.7 腎組織nephrin及podocin蛋白表達的分析

①腎組織總蛋白的提取及蛋白定量 取－80℃保存的腎組織約100 mg，置入1.5 mL的Eppendorf管中，加入預冷的裂解緩沖液1 mL，于冰浴中用超聲破碎儀勻漿3次，后置于冰上20 min;4℃、12000 r/min離心15 min;吸取上清置于另一1.5 mL Eppendorf管中，－80℃保存2 d，解凍后12000 r/min離心15 min，取上清即為所提取的蛋白溶液。取少量上清按照BCA蛋白定量試劑盒操作步驟進行定量。將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合加2×LB上樣緩沖液后于100℃煮沸變性5 min，保存于－20℃冰箱。剩余蛋白分裝后－80℃低溫儲存。

②Western blotting檢測nephrin及podocin蛋白表達取出已變性的蛋白樣品。每孔加50 μg蛋白樣品電泳，積層膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。電泳結束后轉膜1－2 h(經甲醇處理的PVDF膜)，將轉有蛋白的膜置于5%BSA封閉1 h后，置于I抗(nephrin、podocin I抗分別用封閉液 1∶400、1∶2000 稀釋，GAPDH內參照按1∶5000稀釋)中，置4℃冰箱中振蕩過夜，1×TTBS洗3次，每次10 min。置HRP標記的Ⅱ抗(用封閉液1∶5000稀釋)中孵育2 h，1×TTBS洗3次，每次10 min，在暗室取ECL劑A和B各1 mL，混合后覆蓋膜上，1.5 min后棄去化學發光試劑，將膜放入暗盒內，用X光膠片進行曝光、顯影及定影。條帶相對灰度值:目的條帶灰度值/同個樣品GAPDH灰度值。

4 統計學處理

結 果

1 一般情況

正常對照組大鼠精神狀況良好，毛皮有光澤，動作自如反應靈敏。STZ組大鼠精神萎靡，反應遲鈍，活動倦怠，毛發雜亂泛黃無光澤偶有脫毛，尿量多，每天換墊料1－2次，體重下降明顯;STZ+APS組大鼠反應較靈敏，毛色可，尿多、體重較STZ大鼠有所增加。

2 各組大鼠體重和腎指數的比較

與正常對照組比較，STZ組大鼠體重明顯降低、腎指數明顯升高(P＜0.01);與STZ組比較，STZ+APS組大鼠體重明顯升高、腎指數明顯降低 (P＜0.05)，見表 1。

表1 各組大鼠體重和腎指數比較Table1.Comparison of the body weight and renal index in rats of different groups(.n=8)

表1 各組大鼠體重和腎指數比較Table1.Comparison of the body weight and renal index in rats of different groups(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs STZ group.

Group Body weight(g)Renal index Control 519.0 ±52.6 5.5 ±1.4 STZ 221.0 ±19.4＊＊ 15.2 ±2.8＊＊STZ+APS 261.0 ±25.4＊＊# 12.1 ±2.0＊＊#

3 各組大鼠血糖的比較

STZ組大鼠在造模成功后，隨時間的推移血糖逐漸穩定;而STZ+APS組大鼠隨著黃芪多糖干預時間的延長，血糖逐漸降低，第8周時大鼠血糖明顯下降(P ＜0.05)，見表2。

表2 黃芪多糖對各組大鼠血糖的影響Table2.The effect of APS on blood glucose concentration in diabetic rats(mmol/L..n=8)

表2 黃芪多糖對各組大鼠血糖的影響Table2.The effect of APS on blood glucose concentration in diabetic rats(mmol/L..n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs STZ group

Post－treatment Group Pre－treatment2 weeks 5 weeks 8 weeks Control 4.47 ±0.28 4.53±0.27 4.44±0.26 4.40 ±0.24 STZ 23.90±3.52＊＊ 24.60±3.96＊＊ 25.2±4.79＊＊ 25.01±4.84＊＊STZ+APS 23.50±2.98＊＊ 23.60±3.17＊＊ 23.4±2.96＊＊ 21.90±2.57＊＊#

4 各組大鼠24 h尿蛋白總量及血液生化指標比較

STZ組大鼠24 h尿蛋白總量明顯高于正常對照組(P＜0.01)，黃芪多糖干預后，大鼠24 h尿蛋白總量明顯低于STZ組(P＜0.05)。與正常對照組比較，STZ組大鼠血尿素氮、血肌酐有明顯增高(P＜0.01)，而黃芪多糖干預后，大鼠血尿素氮和血肌酐均有明顯下降(P＜0.05)，見表3。

表3 各組大鼠24 h尿蛋白總量，尿素氮和肌酐比較Table3.Comparison of the 24－hour total urine protein，BUN and SCr in rats of different groups(.n=8)

表3 各組大鼠24 h尿蛋白總量，尿素氮和肌酐比較Table3.Comparison of the 24－hour total urine protein，BUN and SCr in rats of different groups(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs STZ group.

Total urineBUNSCr Group protein(mg)(mmol·L －1)(μmol·L －1)Control 7.2 ±2.7 5.36 ±1.89 75.00 ±8.22 STZ 71.9 ±11.8＊＊ 10.90 ±2.49＊＊ 134.00 ±17.02＊＊STZ+APS 44.7 ±8.14＊＊# 9.31 ±1.92＊＊# 115.00 ±11.12＊＊##

5 各組大鼠腎組織病理變化

HE染色可見正常對照組大鼠腎組織形態正常，小球形態規則，小管排列緊密整齊，腎小管上皮細胞形態正常，見圖1A、B。STZ組大鼠腎小球肥大、毛細血管基底膜增厚，系膜基質增生，腎小管上皮細胞空泡樣變，可見蛋白管型，見圖1C、D。STZ+APS組大鼠腎小球形態基本正常，僅有少量腎小管上皮細胞空泡樣變，病變明顯輕于STZ組，見圖1E、F。

Figure1.The pathological changes of rat kidney tissues in different groups(HE staining，×400).A，B:control group;C，D:STZ group;E，F:STZ+APS group.圖1 各組大鼠腎組織病理變化

6 黃芪多糖對DN大鼠nephrin和podocin表達的影響

STZ組大鼠腎組織nephrin的水平明顯低于正常對照組(P＜0.01)，STZ+APS組大鼠腎組織nephrin表達明顯高于STZ組(P＜0.05)，見圖2。糖尿病大鼠腎組織podocin表達明顯低于正常對照組(P＜0.01)，STZ+APS組大鼠腎組織podocin表達明顯高于STZ組(P＜0.05)，見圖3。

Figure2.Protein expression of nephrin was detected by Western blotting.The GAPDH was used as self－ control.A:the result of Western blotting;B:the ratio of nephrin protein band density to GAPDH band density.Lane 1，2:control group;Lane 3，4:STZ group;Lane 5，6:STZ+APS group..n=4.＊＊P＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs STZ group.圖2 各組大鼠腎組織nephrin蛋白表達的比較

討 論

糖尿病腎病屬中醫消渴并發水腫的范疇。在中醫學中雖無糖尿病腎病的病名，但對本病的病機及癥狀早有論述。按其發病機制、臨床表現隸屬于“虛勞”、“腎勞”、“水腫”、“脹滿”、“吐逆”、“腎消”、“關格”等范疇。黃芪味甘，性微溫，歸肺、脾經。具有補氣升陽，益氣固表，斂瘡生肌，利水消腫之功效?！睹t別錄》記載:“治丈夫虛勞，五勞羸瘦、止渴、腹痛泄痢，益氣，利陰氣”，歷代醫家均用之治消渴。研究者統計治療消渴的方劑，古方中使用黃芪者占20.5%，現代方使用黃芪者占63.8%，利用司氏歸納法分析多個治療糖尿病的方劑發現，藥物應用次數最多是黃芪[6]。

Figure3.Protein expression of podocin was detected by Western blotting.The GAPDH was used as self－ control.A:the result of Western blotting;B:the ratio of podocin protein band density to GAPDH band density.Lane 1，2:control group;Lane 3，4:STZ group;Lane 5，6:STZ+APS group..n=4.＊＊P＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs STZ group.圖3 各組大鼠腎組織podocin蛋白表達的比較

糖尿病腎病是糖尿病常見的微血管并發癥，其發生發展是遺傳易感性及高血糖之間長期相互作用，多因素共同參與的結果，基本病理改變為腎小球基底膜增厚和系膜區大量基質樣物質增生，臨床表現為持續的尿蛋白排泄增加。足細胞結構及功能的改變是蛋白尿產生的病理基礎，并成為糖尿病腎病持續進展的關鍵因素[7，8]。腎小球疾病引起足突融合、裂孔隔膜結構紊亂后，多種足細胞特異性標志蛋白(如:nephrin與podocin)隨之發生改變，從而影響足細胞結構和功能。Nephrin是組成裂孔隔膜的主要成分，并特異性表達于裂孔隔膜上的一種跨膜蛋白。Toyoda等[9]利用原位雜交的方法檢測到糖尿病腎病患者足細胞nephrin mRNA表達明顯減少，且與糖尿病腎病蛋白尿的進展呈負相關。Barutta等[10]利用RT－PCR方法檢測到STZ誘導的實驗性糖尿病小鼠腎組織nephrin mRNA表達減少，采用免疫組化、免疫印跡方法檢測到小鼠腎臟nephrin蛋白表達下降。本研究發現，DN大鼠腎臟nephrin蛋白表達降低，與以往研究結果一致。關于DN足細胞nephrin蛋白可能的去向有兩種:其一，高糖環境中，機體合成的nephrin剪接異構體缺乏跨膜區域，使其在裂孔隔膜上失去穩定性，易于脫離裂孔隔膜到尿液中，使 nephrin 蛋白表達水平降低[11，12];其二，糖尿病狀態下，高糖激活PKC可以誘導足細胞發生胞吞作用，將nephrin吞噬到細胞內，使 nephrin表達減少[13]。Podocin是繼nephrin后發現的一種特異性表達于裂孔隔膜的膜蛋白，呈發夾樣的結構。Baelde等[14]研究發現糖尿病腎病患者足細胞podocin蛋白表達降低，且其表達減少與尿蛋白增加相關。研究證實podocin羧基末端與nephrin胞內段羧基末端相互作用參與nephrin與細胞骨架的連接，可加強nephrin誘導的信號轉導[15]。本實驗發現，DN大鼠足細胞nephrin和podocin的蛋白表達水平同時下降，它們之間是否存在因果關系有待于進一步研究。

本研究結果顯示，DN大鼠血糖、腎系數、24 h尿蛋白總量、血尿素氮和血肌酐明顯升高，體重明顯下降;腎組織病理見腎小球肥大，毛細血管基底膜增厚，系膜基質增生，腎小管上皮細胞空泡樣變，見蛋白管型，nephrin和podocin表達減少。從模型大鼠的腎功能變化和病理改變來看，本實驗成功復制了大鼠糖尿病腎病模型。應用黃芪多糖干預后，發現其可以減輕糖尿病腎臟病理改變，改善腎功能，并降低血糖，同時維持nephrin和podocin蛋白的表達。由此可見，黃芪多糖對DN腎臟保護作用的機制可能與降低血糖、穩定DN狀態下足細胞nephrin和podocin表達量相關。

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