妊娠合并急性胰腺炎大鼠胎盤組織細(xì)胞黏附分子E－選擇素的表達(dá)及意義*

徐麗南，林 楠，張 穎，蔡 堅(jiān)，王子蓮

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510080;2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510630)

急性胰腺炎是臨床上常見(jiàn)的急腹癥之一。在妊娠過(guò)程中合并急性胰腺炎發(fā)生率在3/10000左右[1]。國(guó)外報(bào)道其死亡率占妊娠合并急腹癥的首位(54.6%)。急性胰腺炎引起的炎癥反應(yīng)可以導(dǎo)致胎盤功能發(fā)生一系列改變，其中黏附分子在炎癥與胎盤功能改變中起了重要的介導(dǎo)作用。本研究的目的在于探討細(xì)胞黏附分子E－選擇素(E－selectin)在妊娠合并急性胰腺炎的作用，通過(guò)對(duì)血清與胎盤組織中E－selectin表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)，分析其與胰腺損傷和胎盤功能之間的關(guān)系。

材料和方法

1 動(dòng)物分組

雌性Wistar大鼠60只(購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重250－300 g;隨機(jī)分為正常妊娠對(duì)照組(10只)、妊娠合并胰腺炎不同時(shí)點(diǎn)組(胰腺炎1、4、8、12、24 h 組，每組各為10 只)。

2 方法

2.1 妊娠大鼠模型制備 于發(fā)情期將雌、雄大鼠各1只合籠過(guò)夜，次晨制作陰道拭子涂片，以顯微鏡下檢出精子之日定為受孕第1 d。

2.2 急性胰腺炎模型的制備 妊娠7 d大鼠實(shí)驗(yàn)前12 h開(kāi)始禁食，自由飲水。戊巴比妥溶液20 mg/kg行腹腔內(nèi)麻醉。固定，經(jīng)上腹正中切口入腹，提起十二指腸以小號(hào)血管夾分別夾住十二指腸段和肝門部胰膽管。TB針(4.5針頭，1 mL注射器)穿刺胰膽管，微泵注射5%牛磺膽酸鈉(1 mL/kg)，持續(xù)1 min，停留5 min，然后拔除針頭，去除血管夾。可觀察大鼠胰腺組織明顯水腫、出血，縫合腹壁各層。

2.3 取材方法 妊娠合并胰腺炎模型造模成功后1、4、8、12、24 h 將大鼠剖腹，肉眼觀察胰腺炎癥輕重情況。下腔靜脈穿刺取血，室溫下凝集30 min，4℃離心10 min，取上清液，－70℃儲(chǔ)存用于檢測(cè)E－selection。

取胰頭固定位置胰腺組織，10%甲醛固定，制成石蠟切片，用于HE染色。所有孕鼠均將胎盤娩出后分為2份，1份經(jīng)Trizol提取RNA后存放入－70℃冰箱用于RT－PCR檢測(cè)，1份直接放入－70℃冰箱用于蛋白免疫印跡檢測(cè)。

2.4 血清脂肪酶測(cè)定 以全自動(dòng)生化分析儀采用酶顯色法測(cè)定大鼠血清脂肪酶。

2.5 血清E－selectin測(cè)定 應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定血清 E－selectin(R＆D公司試劑盒)。

2.6 病理學(xué)檢查 采用盲法，由病理科醫(yī)生在光鏡下觀察胎盤改變。胰腺損傷組織學(xué)評(píng)分:以改良Schmidt等[2]法，并參照 Pozsar等[3]的方法對(duì)胰腺損傷進(jìn)行評(píng)分。觀察胎盤有無(wú)白細(xì)胞浸潤(rùn)、微小血栓形成、胎盤絨毛萎縮、合體小結(jié)、纖維蛋白沉積、鈣化，胎盤梗死，有上述任一改變?yōu)?分。正常胎盤(normal placenta)為0－1分;輕度胎盤損傷(mild impairment)為2－3分;中度胎盤損傷(moderate impairment)為4－5分;重度胎盤損傷(severe impairment)為6－7分。

2.7 RT－PCR 法 E －selectin引物根據(jù)文獻(xiàn)[4]，序列如下:E－selectin(509 bp)，上游引物5’－AAAATGTTCAAGCCTGGCAGTTCC －3’，下游引物5’－GTGGTGATGGGTGTTGCGGTTTCA－3’。β－actin(內(nèi)參照，389 bp)，上游引物5’－CTTCCTGGGCATGGAGTCCT－3’，下游引物5’－ GGAGCAATGATCTTGATCTTC－3’。取胎盤組織50－100 mg，提取總RNA(R＆D公司試劑盒)，合成cDNA，－20℃保存，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 5 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶0.5 mg/L)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描各電泳帶的灰度值，以UVP凝膠密度掃描儀及其分析軟件進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

2.8 免疫印跡法 (Western blotting) 取凍存的胎盤組織少量提取蛋白質(zhì)。采用考馬斯亮蘭G－250染色法(Bradford法)蛋白質(zhì)定量。Western blotting采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白電泳條帶的灰度值。在灰度值中0為黑色，255為白色，依據(jù)顏色深淺范圍為0－255。條帶越深值越低，條帶越淺值越高。為了更直觀地進(jìn)行比較，將實(shí)際測(cè)得值用255減去，獲得校正值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 妊娠合并急性胰腺炎大鼠模型

妊娠7 d大鼠開(kāi)腹，胰膽管逆行注入5%牛磺膽酸鈉后，觀察到胰管周圍胰腺組織顏色立即變紅，并逐漸擴(kuò)展、加深。于 1 h、4 h、8 h、12 h、24 h 抽血檢查血清脂肪酶，均較正常妊娠組明顯升高，見(jiàn)表1，造模成功。

2 妊娠合并急性胰腺炎大鼠血清與胎盤組織E－selectin水平的變化

正常妊娠大鼠血清與胎盤組織內(nèi)E－selectin呈低水平表達(dá)。妊娠合并急性胰腺炎模型組，血清與胎盤組織內(nèi)的E－selectin較正常妊娠組明顯升高，其中12 h組與24 h組顯著升高，見(jiàn)表1、圖1。

表1 妊娠合并急性胰腺炎大鼠血清脂肪酶/E－selectin與胎盤組織E－selectin的變化Table1.The expression of lipase/E－selectin in serum and E－selectin in placenta tissues of pregnant rats with acute pancreatitis(.n=10)

表1 妊娠合并急性胰腺炎大鼠血清脂肪酶/E－selectin與胎盤組織E－selectin的變化Table1.The expression of lipase/E－selectin in serum and E－selectin in placenta tissues of pregnant rats with acute pancreatitis(.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs other groups.

Group Serum lipase(U/L)E－selectinn protein in placenta tissues Control Serum E －selectin(μg/L)E－selectin mRNA in placenta tissues 90 ±23 34.8 ±1.0 0.12 ±0.01 32.20 ±1.25 Acute pancreatitis with pregnancy 1 h 2600 ±128＊＊ 46.6 ±0.9* 0.23 ±0.09* 112.30 ±3.78*4 h 2867 ±189＊＊ 50.4 ±1.2* 0.44 ±0.11* 142.20 ±4.05*8 h 2832 ±109＊＊ 54.7 ±0.9* 0.66 ±0.09* 153.30 ±4.09*12 h 3020 ±220＊＊ 65.8 ±0.8＊＊△△ 0.92 ±0.04＊＊△△ 163.50 ±3.23＊＊△△24 h 2900 ±195＊＊ 61.9 ±1.3＊＊△△ 0.89 ±0.12＊＊△△ 144.10 ±3.68＊＊△△

Figure1.The expression of E－selectin in placenta tissues of pregnant rats with acute pancreatitis.A:RT－PCR，β－actin was used as a control;B:Western blotting，β － actin was used as an internal control.圖1 妊娠合并急性胰腺炎大鼠胎盤的E－選擇素表達(dá)

3 妊娠合并急性胰腺炎大鼠胰腺及胎盤組織的病理學(xué)改變與評(píng)分

大體觀察見(jiàn)胰腺?gòu)脑炷? h開(kāi)始至24 h水腫逐漸加重，從1 h開(kāi)始有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，從4 h開(kāi)始出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，12 h出現(xiàn)大片狀壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、部分腺葉正常結(jié)構(gòu)消失，并開(kāi)始出現(xiàn)肌上皮增生，24 h組織變薄，結(jié)構(gòu)模糊，可見(jiàn)明顯增生的肌上皮，從4 h開(kāi)始可見(jiàn)到個(gè)別大鼠有點(diǎn)狀出血，見(jiàn)圖2。胰腺損傷病理評(píng)分:妊娠合并胰腺炎的胰腺損傷病理評(píng)分與正常對(duì)照組比較有顯著差異。

Figure2.HE staining of pancreatic tissues in each group under light microscope(×100).A:control group;B:1 h group;C:4 h group;D:8 h group;E:12 h group;F:24 h group.圖2 各組大鼠的胰腺組織HE染色

正常對(duì)照組大鼠胎盤組織肉眼及光鏡下均未見(jiàn)明顯病變。妊娠合并胰腺炎1 h組大鼠胎盤組織可見(jiàn)白細(xì)胞浸潤(rùn);8 h組大鼠胎盤組織損傷加重，微小血栓形成、胎盤絨毛萎縮、纖維蛋白沉積、少量鈣化。12 h與24 h組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加，大鼠胎盤組織損傷嚴(yán)重，可見(jiàn)多數(shù)鈣化，見(jiàn)圖3。胰腺及胎盤組織病理評(píng)分與胎盤功能分級(jí)見(jiàn)表2。

表2 妊娠合并胰腺炎大鼠胰腺及胎盤組織病理評(píng)分與胎盤損傷分級(jí)Table2.Pancreatic histopathological score，placental pathological score and placental classification of pregnant rats with acute pancreatitis(.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs other groups.

Group Pancreatic histopathological score Placental classification Control Placental pathology score Severe 0.40 ±0.10 Normal Acute pancreatitis with pregnancy 1 h 2.67±0.38* 2.20±0.28* Mild 4 h 2.83±0.48* 2.70±0.56* Mild 8 h 3.83±0.61* 4.20±0.68* Moderate 12 h 5.33±0.49＊＊△△ 6.10±0.28＊＊△△ Severe 24 h 4.50±0.42＊＊△△ 6.30±0.63＊＊△△1

4 相關(guān)性分析

采用線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，妊娠合并胰腺炎大鼠血清E－selectin的升高與胰腺損傷程度呈正相關(guān)(r=0.908)，與胎盤損傷程度呈正相關(guān)(r=0.803)。

討 論

妊娠合并急性胰腺炎可以造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)導(dǎo)致圍產(chǎn)期嬰兒死亡的發(fā)生率升高，胎兒的死亡率可高達(dá)10% －20%[5]。造成該妊娠不良結(jié)局的原因與急性胰腺炎產(chǎn)生的大量炎癥因子對(duì)胎盤功能的損傷有關(guān)。急性胰腺炎引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)同時(shí)釋放大量炎癥介質(zhì)，刺激巨噬細(xì)胞釋放而引起高細(xì)胞因子血癥，在黏附分子的介導(dǎo)下，白細(xì)胞在器官集聚，隨后釋放大量的酸性水解酶、彈力蛋白酶及各種氧自由基損害組織造成胎盤功能受損[6]。在這個(gè)過(guò)程中黏附分子E－選擇素(E－selectin)、L－選擇素 (L－selectin)、P－選擇素(P－selectin)、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule －1，VCAM－1)和細(xì)胞間黏附分子 －1(inter－cellular adhesion molecule，ICAM－1)起了重要的介導(dǎo)作用。其中E－selectin是起始黏附作用的關(guān)鍵因子[7]。

在胰腺炎引起的炎癥反應(yīng)中，血循環(huán)中的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過(guò)程是由白細(xì)胞表面的黏附分子E－selectin與內(nèi)皮細(xì)胞的同源配體相結(jié)合完成的[8]。通過(guò)黏附分子共同介導(dǎo)，形成“白細(xì)胞－內(nèi)皮細(xì)胞黏附的級(jí)聯(lián)”。一旦白細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮，即可通過(guò)一系列機(jī)制導(dǎo)致胎盤血管功能障礙及內(nèi)皮細(xì)胞損傷。內(nèi)皮細(xì)胞受TNF－α、IL－1刺激后可合成E－selectin，約1 h后在細(xì)胞表面表達(dá)，4－8 h達(dá)到高峰，可持續(xù)24－48 h[9]。由于 E－selectin表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)致大量白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等黏附到胎盤血管內(nèi)皮[10]，導(dǎo)致胎盤血管功能障礙和組織損傷，故E－selectin的異常表達(dá)增高，標(biāo)志著血管內(nèi)皮損傷及功能障礙[11]，提示胎盤功能受到影響。

本研究觀察妊娠合并急性胰腺炎動(dòng)物模型的胎盤組織中E－selectin表達(dá)的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示，正常大鼠胎盤組織E－selectin呈低水平表達(dá)，誘導(dǎo)胰腺炎后1 h，大鼠胎盤組織內(nèi)E－selectin mRNA表達(dá)略有增加，并隨時(shí)間的推移而增加，在12 h達(dá)到高峰。而且在內(nèi)皮細(xì)胞與滋養(yǎng)細(xì)胞上均有相同情況出現(xiàn)，這些變化表明大鼠胎盤組織內(nèi)E－selectin的表達(dá)在急性胰腺炎胎盤損傷的早期過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果提示E－selectin的水平表達(dá)與妊娠合并胰腺炎大鼠胎盤損傷程度、胰腺損傷程度呈正相關(guān)。隨著血液與胎盤組織中的E－selectin的濃度增加，胰腺炎的病情加重，妊娠胎盤的損傷也加重，導(dǎo)致最后不良的妊娠結(jié)局。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，血清的E－selectin的變化趨勢(shì)與胎盤組織一致。血清E－selectin的升高與胎盤組織損害相關(guān)，E－selectin可能參與了妊娠合并急性胰腺炎胎盤損傷的病理生理過(guò)程

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