ERK通路和三七總皂苷干預在低氧高二氧化碳性肺動脈高壓中的作用*

朱阿楠，王園園，王淑君，金可可，汪 洋，王萬鐵△

(1溫州醫學院病理生理學教研室，浙江 溫州 325035;2余姚市中醫醫院內科，浙江 余姚 315400)

低氧高二氧化碳性肺動脈高壓(hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)發展到肺心病的中心環節，HHPH的產生及嚴重程度明顯影響著 COPD和肺心病的病程和預后。近年來的研究表明:MAPKs信號轉導通路在將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞生物學反應的過程中具有至關重要的作用[1]，且肺動脈高壓的發生可能與該通路的激活有關[2]。本文研究了ERK信號通路在大鼠低氧高二氧化碳性肺動脈高壓發生發展中的動態變化，并探討三七總皂苷(Panax notoginoside，PNS)防治低氧高二氧化碳性肺動脈高壓的機制。

材料和方法

1 慢性低氧高二氧化碳肺動脈高壓動物模型的復制

雄性 SD大鼠72只(體重200－220 g)，隨機分成6組(n=12)，即正常組(N)、低氧3 d組(H3d)、1周組(H1w)、2周組(H2w)、4周組(H4w)和血塞通(成分為三七總皂苷)治療組(Hp)。將后5組大鼠放入常壓低氧高二氧化碳艙內，艙內氧氣濃度維持在9% －11%，二氧化碳濃度維持在5% －6%(艙內水蒸汽用無水 CaCl2吸收，多余二氧化碳用氫氧化鈣吸收)，每天8 h，每周6 d。Hp組于每天進艙前30 min腹腔注射血塞通注射液(50 mg·kg－1·d－1)，其余各組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。N組置于艙外，自由呼吸空氣，其它組飼養條件相同。

2 模型建立

每組隨機取10只大鼠。采用右心導管法自頸外靜脈插管至肺動脈，并行頸總動脈插管，經Power-Lab生理記錄儀分別測定平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)及平均頸動脈壓(mean carotid arterial pressure，mCAP)。

放血處死動物，分別稱取右室(right ventricle，RV)和左室加室間隔(left ventricle+septum，LV+S)的重量，并計算出RV/(LV+S)的重量比，作為右室肥大的指標。以mPAP、mCAP和RV/(LV+S)作為判斷模型建立成功的指標。

3 肺細小血管顯微結構觀察

取肺組織，常規石蠟制片(厚度5 μm)，HE染色，顯微鏡觀察并拍照。每只大鼠隨機選1張肺組織切片，每張切片隨機選直徑50－200 μm肺細小動脈5支，用IPP5.0(Image－Pro Plus)彩色圖像分析系統測定肺細小動脈管壁面積/管總面積(vessel wall area/total area，WA/TA)，管腔面積/管總面積(vessel cavity area/total area，EA/TA)。

4 肺細小動脈ERK的免疫組化檢測及結果處理

肺組織石蠟切片常規脫蠟至水，3%H2O2室溫處理 10 min，滴加Ⅰ抗(1∶100)，37 ℃孵育 1 h，再滴Ⅱ抗、SABC、3，3－二氨基苯聯胺(DAB)顯色，陽性結果呈棕黃色。隨機選取直徑50－200 μm的肺內動脈10條，采用IPP5.0(Image－Pro Plus)彩色圖像分析系統測定陽性部位及背景的吸光度值，以陽性部位的吸光度值減背景的吸光度值代表陽性部位的吸光度(absorbance，A)值。

5 蛋白免疫印跡法檢測肺組織中磷酸化ERK蛋白含量及圖像處理

各組取肺組織100 mg，剪碎轉移至玻璃勻漿器中，加入含1 mmol/L PMSF的裂解液1000 μL，勻漿以充分裂解肺組織。超聲粉碎儀裂解細胞5 s×4次后 ，12000 r/min離心 5 min，吸取上清，分裝，－80℃保存。BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度:用蛋白標準品作出標準曲線，紫外分光光度計測定樣品吸光度，根據標準曲線得出樣品的蛋白濃度，調節蛋白濃度，上樣量為40 μg。蛋白質電泳和印跡電轉移:SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳配置質量分數為10%的分離膠和5%的濃縮膠，電泳條件:恒壓，先80 V，待溴酚藍到達分離膠后改電壓為130 V，直至溴酚藍跑到凝膠底部;電泳結束后進行印跡轉移，應用聚乙烯二氟(PVDF膜)380 mA恒流電轉40 min，轉移完畢后分別用立春紅和考馬斯亮蘭染膜和膠。Western印跡分析:采用質量分數為5%BSA的TBST封閉液室溫封閉1 h，TBST洗膜3次后，加入單克隆兔抗大鼠磷酸化 ERK或單克隆兔抗大鼠總ERK(總ERK為磷酸化ERK起校正內參的作用，濃度均為1∶1000稀釋)，于4℃ 孵育過夜，第2 d加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶2000稀釋)，室溫置1 h;TBST洗膜3次，化學發光底物ECL顯色、膠片曝光，用UVP凝膠成像掃描系統對膠片條帶進行定量性密度測定，Quantity One軟件計算其灰度值。

6 統計學處理

結 果

1 各組大鼠mCAP、mPAP和RV/LV+S的比較

1.1 各組大鼠mCAP的比較 N組、H3d組、H1w組、H2w組、H4w組和 Hp組大鼠間 mCAP無明顯差異(P＞0.05)，見表1。這說明低氧高二氧化碳對大鼠的體循環壓沒有影響。

1.2 各組大鼠 mPAP的比較 與N組相比，H3d組mPAP無明顯升高(P＞0.05)。隨著低氧時間的延長，H1w組、H2w組、H4w組和 Hp組的 mPAP均高于 N組(均P＜0.05)，且各組之間差異明顯(P＜0.05)。說明隨著低氧時間的延長，大鼠mPAP1周時即開始明顯升高，4周后達到較高水平。同時可見Hp組mPAP明顯低于H4w組(P＜0.05)，見表1。這說明PNS可減輕低氧高二氧化碳大鼠的肺動脈高壓。

表1 慢性低氧高二氧化碳及PNS對大鼠mPAP、mCAP和RV/LV+S的影響Table1.Effect of chronic hypoxia hypercapnia on mPAP，mCAP and RV/LV+S of rats(.n=10)

表1 慢性低氧高二氧化碳及PNS對大鼠mPAP、mCAP和RV/LV+S的影響Table1.Effect of chronic hypoxia hypercapnia on mPAP，mCAP and RV/LV+S of rats(.n=10)

*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs H3dgroup;▲P＜0.05 vs H1wgroup;☆P ＜0.05 vs H2wgroup;★P ＜0.05 vs H4wgroup.

Group mPAP(mmHg) mCAP(mmHg) RV/LV+S(%)N 11.00 ±0.62 107.46 ±6.40 23.41 ±0.97 H3d 11.84 ±0.49 110.13 ±5.44 24.29 ±1.02 H1w 13.54 ±0.65＊△ 109.19 ±4.99 24.76 ±1.04 H2w 16.85 ±0.88﹡△▲ 108.03 ±4.92 30.19 ±0.95*H4w 23.12 ±0.53＊△▲☆ 114.85 ±9.87 36.04 ±0.65＊△▲Hp 18.74 ±0.74＊△▲☆★ 106.32 ±6.34 31.57 ±0.69＊△▲★

1.3 各組大鼠RV/LV+S的比較 隨著低氧時間的延長，H2w、H4w和Hp組的RV/LV+S均高于 N 組(均P＜0.05)，但H3d組、H1w組的RV/LV+S較N組增加不明顯(均P＞0.05)。這說明隨著低氧時間的延長，大鼠2周后RV/LV+S即開始明顯升高，而且逐漸增加，第4周達較高水平。同時可見Hp組RV/LV+S明顯低于H4w組(P＜0.05)，見表1。這說明PNS可減輕低氧高二氧化碳大鼠的右心室肥厚。

2 光鏡下各組大鼠肺細小動脈結構的比較

光鏡下所見，N組，平滑肌層未見明顯增生，管壁均勻一致，而隨著缺氧間期的延長，H1w組、H2w組、H4w組和Hp組內彈力板扭曲明顯，中膜平滑肌細胞增生，管腔明顯狹窄，但H3d組改變不明顯，見圖1A－F。Hp組與H4w組比較，其血管壁的改變明顯減輕，見圖1E －F。隨著低氧時間的延長，H1w、H2w、H4w和 Hp組 WA/TA均高于N組(均P＜0.05)，但H3d組較N組增加不明顯(P＞0.05)。這說明隨著低氧時間的延長，大鼠1周后肺小動脈管壁開始增厚，第4周達較高水平。同時可見Hp組WA/TA明顯低于H4w組(P＜0.05)，見表2。這說明 PNS可減輕低氧高二氧化碳大鼠肺小動脈管壁增厚。

表2 慢性低氧高二氧化碳及PNS對大鼠肺細小動脈結構影響的比較Table2.Effect of chronic hypoxia hypercapnia on pulmonary arteriolar remodeling in rats(.n=8)

表2 慢性低氧高二氧化碳及PNS對大鼠肺細小動脈結構影響的比較Table2.Effect of chronic hypoxia hypercapnia on pulmonary arteriolar remodeling in rats(.n=8)

*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs H3dgroup;▲P＜0.05 vs H1wgroup;☆P＜0.05 vs H2wgroup;★P＜0.05 vs H4w group.

Group WA/TA(%) EA/TA(%)N 28.71 ±2.56 71.39 ±2.56 H3d 30.20 ±2.31 69.80 ±2.31 H1w 35.26 ±2.04＊△ 64.74 ±2.04＊△H2w 44.10 ±2.29＊△▲ 55.90 ±2.29＊△▲H4w 54.98 ±4.21＊△▲☆ 45.02 ±4.21＊△▲☆Hp 46.38 ±1.02＊△▲★ 53.62 ±1.02＊△▲★

3 各組肺組織勻漿磷酸化ERK蛋白表達結果比較

Western blotting結果表明(圖2)，肺組織磷酸化ERK表達隨低氧高二氧化碳時間延長呈動態變化:在N組未見表達，隨低氧高二氧化碳進展，第3 d開始明顯升高，灰度值達(0.313±0.042)，2周時達高峰(0.358±0.043)。第4周時磷酸化水平(0.217±0.030)有所下降，但仍高于正常對照組水平(0.018±0.003)，差異顯著(P＜0.05)。同時可見 Hp組 p－ERK明顯低于 H4w組(P＜0.05)，見表3。

表3 各組肺組織勻漿磷酸化ERK灰度值比較及各組肺小動脈壁磷酸化ERK吸光度值比較Table3.Western blotting analysis of p－ERK expression in lung homogenate(.n=8)，and expression of p－ERK protein in pulmonary arterial walls(.n=10)

表3 各組肺組織勻漿磷酸化ERK灰度值比較及各組肺小動脈壁磷酸化ERK吸光度值比較Table3.Western blotting analysis of p－ERK expression in lung homogenate(.n=8)，and expression of p－ERK protein in pulmonary arterial walls(.n=10)

*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs H3dgroup;▲P ＜0.05 vs H1wgroup;☆P ＜0.05 vs H2wgroup;★P ＜0.05 vs H4wgroup.

Group p－ERK inp－ERK in lung homogenatepulmonary arterial walls N 0.018 ±0.003 0.107 ±0.016 H3d 0.313 ±0.042* 0.133 ±0.018*H1w 0.339 ±0.053* 0.174 ±0.032＊△H2w 0.358 ±0.043＊△ 0.181 ±0.027＊△H4w 0.217 ±0.030＊△▲☆ 0.185 ±0.021＊△Hp 0.163 ±0.022＊△▲☆★ 0.157 ±0.020＊△☆★

Figure1.Morphological changes in pulmonary arteriole walls(HE staining，×400).A:normal group;B:hypoxic hypercapnia for 3－day group;C:hypoxic hypercapnia for 1－week group;D:hypoxic hypercapnia for 2－week group;E:hypoxic hypercapnia for 4－week group;F:PNS －injected group.圖1 光鏡下肺細小動脈管壁結構變化

4 各組肺小血管壁磷酸化ERK蛋白表達變化

正常組肺小動脈壁磷酸化ERK表達呈陰性或弱陽性(圖3A)，隨著低氧高二氧化碳進展，其表達變化主要見于肺小動脈(表3)。且主要表達在肺小動脈中膜(平滑肌細胞)和內膜(內皮細胞)，外膜也有表達(成纖維細胞)。3 d時磷酸化ERK在大鼠肺小動脈壁核表達呈強陽性(圖3B)，1周、2周、4周時也有較強活性(圖3C、3D、3E)。PNS治療組磷酸化ERK表達減弱(圖3F)。

Figure2.Western blotting analysis of p－ERK expression in lung homogenate.圖2 Western blotting檢測各組大鼠p－ERK表達

討 論

HHPH中晚期改變以肺血管重建為主，其病理改變為:細胞外基質成分如膠原纖維和彈力纖維的增多，中膜平滑肌細胞肥大和增生，非肌型動脈形成新肌層化，內皮細胞腫脹和肥大，從而導致肺動脈管壁增厚和管腔狹窄[3]甚至消失，引起肺血管阻力增加，導致肺動脈高壓甚至右心室衰竭[4]。本實驗結果表明，隨著低氧高二氧化碳時間的延長和模型復制的進展，大鼠肺動脈平均壓和右心指數呈動態增高，2周組和4周組均顯著高于正常對照組，光鏡下示肺細小動脈內彈力板扭曲，中層平滑肌及外膜膠原纖維增生，管腔狹窄，說明低氧性高二氧化碳肺動脈高壓和右心室肥厚模型已建立成功。肺血管重建不但是肺動脈高壓持續發展的關鍵因素，而且是對血管擴張降壓藥物產生抵抗的主要原因。目前認為，在低氧、高碳酸等各種刺激因子作用下，肺動脈平滑肌細胞增殖以及膠原等細胞外基質在管壁大量沉積是肺動脈重建的最主要的原因。我們的實驗發現:(1)隨著低氧高二氧化碳時間的延長，大鼠mPAP 1周后即開始明顯升高，4周時達到高峰;(2)隨著低氧高二氧化碳時間的延長，大鼠2周后RV/LV+S即開始明顯升高，4周達最高水平;(3)光鏡下可見，N組肺細小動脈內彈力板自然彎曲，平滑肌層未見明顯增生，管壁均勻一致，而隨著缺氧間期的延長，2周組、4周組內彈力板扭曲明顯，中膜平滑肌細胞增生，管腔明顯狹窄。說明在低氧高二氧化碳性肺動脈高壓形成過程中出現明顯的肺血管重建。

Figure3.Expression of p－ERK protein in pulmonary arterial walls(immunohistochemical staining，×400).A:normal group;B:hypoxic hypercapnia for 3－day group;C:hypoxic hypercapnia for 1－week group;D:hypoxic hypercapnia for 2－week group;E:hypoxic hypercapnia for 4－week group;F:PNS －injected group.圖3 p－ERK蛋白在肺小動脈管壁內膜、中膜和外膜表達

許多研究[5，6]結果表明，一些促細胞增殖的因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growthfactor，FGF)都能直接或間接激活MAPK途徑(其中ERK信號途徑被認為是經典的MAPK信號轉導途徑)，參與細胞骨架的形成和細胞遷移的過程，促進血管內皮細胞及平滑肌細胞分裂、增殖。而這些促增殖因子往往都可由低氧激活:研究證實[7]缺氧可上調VEGF的表達水平。ERK信號通路被激活的結果主要是促進血管內皮細胞的增殖[8，9]并通過自分泌和旁分泌作用于肺血管平滑肌細胞(pulmonary vascular smooth muscle cells，PVSMCs)使其增殖。在體外培養的新生鼠心肌細胞上，缺氧/復氧可同時激活 ERK、p38 MAPK 和 JNK 這三類酶[10，11]。Steinbach等[12]研究表明，癌細胞乏氧后會激活MAPK信號轉導通路，促進VEGF和EGFR的表達，保護癌細胞避免乏氧誘導的細胞死亡。我們的實驗也發現，(1)肺組織磷酸化ERK表達隨低氧高二氧化碳時間延長呈動態變化:在N組未見表達，隨低氧高二氧化碳進展，第3 d開始明顯升高，2周時達高峰，第4周時磷酸化水平有所下降;(2)肺小動脈壁磷酸化ERK蛋白吸光度值變化基本同肺組織勻漿Western blotting結果一致。隨著低氧高二氧化碳進展，其主要表達在肺小動脈中膜和內膜，外膜也有少量表達。進一步研究發現，p－ERK蛋白表達變化趨勢和肺動脈壓力增高、右心肥厚、肺動脈重建的趨勢一致(正相關)。這些結果表明低氧高二氧化碳能夠引起ERK1/2通路的活化;磷酸化ERK蛋白在HHPH中呈動態變化;它們的活化參與了肺動脈高壓的形成以及肺血管的重建，在肺動脈平滑肌細胞、內皮細胞增殖中起重要作用。值得一提的是，p－ERK蛋白在低氧高二氧化碳3d時活性增強，在2周后活性開始下降，說明 ERK1/2通路在低氧高二氧化碳中晚期參與血管重塑的作用減弱。

PNS是目前臨床上廣泛用于心血管病治療的藥物之一，具有擴張血管、降低血液黏度等多種作用 。但目前為止PNS的作用機制還未完全闡明，其與信號轉導通路之間的關系研究更是一大盲區。我們的實驗采用給肺動脈高壓大鼠腹腔注射血塞通注射液(50 mg·kg－1·d－1)，觀察 PNS 在肺動脈高壓中的作用以及與MAPK通路的關系，連續4周后實驗結果顯示，PNS用藥組大鼠與慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓模型組大鼠相比，平均肺動脈壓和右心室重量比都有不同程度的降低，而頸總動脈壓無明顯改變，提示PNS可抑制或預防慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓的形成而對體循環壓無明顯影響，即對低氧高二氧化碳性肺動脈高壓具有選擇性抑制作用。光鏡下示肺細小動脈內彈力板扭曲明顯減輕，中層平滑肌變薄，管壁面積/管總面積比值(WA/TA)明顯降低，管腔面積/管總面積比值(LA/TA)顯著升高。提示PNS具有抑制慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓大鼠的肺血管結構重建作用。以往研究表明，PNS可通過增加血漿、肺組織中 NOS活性和NO含量，增加血漿中 T －SOD、Cu/ZnSOD活性，降低紅細胞比積和減輕內皮細胞損傷而實現防治慢性低氧性肺動脈高壓的形成[13]。周曉霞等[14]研究發現PNS可呈濃度依賴性地抑制VSMCs的增殖并可抑制高脂血清對VSMCs的促增殖作用。提示PNS的抗動脈硬化作用可能是通過抑制VSMC異常增殖實現的。我們的實驗表明，Hp組大鼠肺組織及肺動脈壁p－ERK蛋白表達均有下降，同時Hp組肺血管結構重建較4周組顯著減輕，說明PNS能夠抑制ERK1/2通路活性，從而減輕肺動脈高壓的程度。至于PNS下調ERK1/2信號通路激活與肺動脈平滑肌增殖抑制之間的更深層次機制，有待深入研究及探討。

[1]Nagaoka T，Morio Y，Casanova N，et al.Rho/Rho kinasesignaling mediates increased basal pulmonary vasculartone in chronically hypoxic rats[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，287(4):L665 － L672.

[2]Krens SF，Spaink HP，Snaar－Jagalska BE.Functions of the MAPKs family in vertebrate－development[J].FEBS Lett，2006，580(21):4984 －4990.

[3]Senger DR，Galli SJ，Dvorak AM，et al.Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid[J].Science，1983，219(4587):983 －985.

[4]Marcos E，Fadel E，Sanchez O，et al.Serotonin－induced smooth muscle hyperplasia in various forms of human pulmonary hypertension[J].Circ Res，2004，94(9):1263－1270.

[5]Rousseau S，Houle F，Landry J，et al.p38 MAP kinase activation by vascular endothelial growth factor mediates actin reorganization and cell migration in human endothelial cells[J].Oncogene，1997，15(18):2169 － 2177.

[6]Veikkola T，Karkkainen M，Claessorn－Welsh L，et al.Regulation of angiogenesis via vascular endothelial growth factor receptors[J].Cancer Res，2000，60(2):203 －212.

[7]Zeng H，Dvorak HF，Mukhopadhyay D.Vascular permeability factor(VPF)/vascular endothelial growth factor(VEGF)receptor－1 down－modulates VPF/VEGF receptor－2－mediated endothelial cell proliferation，but not migration，through phosphatidylinositol 3－kinase－dependent pathways[J].J Biol Chem，2001，276(29):26969 － 26979.

[8]Kanno S，Oda N，Abe M，et al.Roles of two VEGF receptors，Flt－ 1 and KDR，in the signal transduction of VEGF effects in human vascular endothelial cells[J].Oncogene，2000，19(17):2138 － 2146.

[9]Meadows KN，Bryant P，Vincent PA，et al.Activated Ras induces a proangiogenic phenotype in primary endothelial cells[J].Oncogene，2004，23(1):192 －200.

[10]Yue TL，Wang C，Gu JL，et al.Inhibition of extracellular signal－regulated kinase enhances ischemia/reoxygenation－induced apoptosis in cultured cardiac myocytes and exaggerates reperfusion injury in isolated perfused heart[J].Circ Res，2000，86(6):692 － 699.

[11]Yin J，Chaufour X，McLachlan C，et al.Apoptosis of vascular smooth muscle cells induced by cholesterol and its oxides in vitro and in vivo[J].Atherosclerosis，2000，148(2):365－374.

[12]Steinbach JP，Klumpp A，Wolburg H，et al.Inhibition of epidermal growth factor receptor signaling protects human malignant glioma cells from hypoxia induced cell death[J].Cancer Res，2004，64(5):1575 －1578.

[13]馬文裴，楊映寧，周定邦，等.三七總皂甙對慢性低氧性肺動脈高壓大鼠的防治作用[J].中國病理生理雜志，2004，20(6):1074 －1077.

[14]周曉霞，蘇佩清，楊鶴梅，等.三七總皂甙對人高脂血清誘發的胎兒血管平滑肌細胞增殖的抑制作用[J].中國動脈硬化雜志，2000，8(1):43－45.