激光多普勒血流儀動態觀察鎂對腦缺血再灌注損傷保護作用

劉 宇，孟 然，，△，吉訓明，NING Ming-ming，王曉英

(1北京大學第九臨床醫學院，首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院神經內科，北京 100038;2首都醫科大學附屬宣武醫院腦血管病研究所，神經變性疾病教育部重點實驗室，北京100053;3Department of Neurology，Massachusetts General Hospital，Harvard Medical School，Boston，Massachusetts 02114，USA)

研究表明多種神經保護措施可在一定程度上阻斷或弱化急性缺血性腦卒中缺血瀑布的不同環節，抑制鈣超載，減少神經細胞凋亡，逆轉半暗帶，提高神經元對缺血的耐受力，為溶栓治療爭得時間，并最終減少梗死體積[1，2]。鎂離子是鈣離子的天然拮抗劑，能夠阻斷由鈣超載引起的細胞損傷途徑，從而保護細胞線粒體的結構和功能、降低血腦屏障通透性、減輕腦水腫、縮小梗死體積[1，2]。病理學研究顯示硫酸鎂能縮小腦梗死體積，是一種有效的神經保護劑[3，4]，但其機制仍不完全清楚。本研究應用激光多普勒血流儀(laser Doppler flowmetry，LDF)對局灶性大腦中動脈阻塞的急性腦梗死大鼠模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)不同時點給予硫酸鎂處理后，缺血/再灌注損傷過程中的腦血流變化特點進行實時動態監測與分析，旨在觀察缺血早期給予硫酸鎂對血管神經單元的保護作用及再灌注后對血管功能的影響，進一步探討其可能的腦保護機制。

材料和方法

1 材料

1.1 藥品與試劑 四氮唑紅(TTC，伊瑞德生物技術公司)、10%水合氯醛(首都醫科大學宣武醫院)、硫酸鎂注射液(杭州民生藥業集團有限公司)。

1.2 主要儀器與設備 激光多普勒血流監測儀(PERIMED，PF5001型)、手術顯微鏡(Carl Zeiss)、線栓(北京沙東技術有限公司，型號2838-A)、電凝刀(Devel Acc 100)。

1.3 動物 SPF級Sprague Dawley(SD)雄性大鼠，體重280-300 g，由維通利華實驗動物有限公司提供，動物許可證:SCXK(京)2006-0009。

2 方法

2.1 動物分組 將24只大鼠隨機分為對照組和硫酸鎂處理組，再根據給藥時不同將硫酸鎂處理組分為插栓后20 min給藥組，30 min給藥組，40 min給藥組，給予25%MgSO4以160 mg/kg劑量腹腔注射;對照組在相同時間點給予等體積生理鹽水腹腔注射。每組6只大鼠，如有意外死亡的情況發生，隨機選取大鼠將每組補足6只。對照組和硫酸鎂處理各組大鼠均經歷2 h缺血隨后24 h再灌注。

2.2 MCAO模型制作 大鼠稱重后，用10%水合氯醛350 mg/kg，腹腔注射麻醉。參照改良 Longa法[5]制作 MCAO模型。頸部備皮，正中剪皮開口，鈍性分離腺體和筋膜，術中小心分離右側頸總動脈 (common carotid artery，CCA)，頸外動脈(external carotid artery，ECA)，電凝ECA上的2個小分支，將ECA近頭端結扎并剪斷，近心端緊貼分叉處穿線打松結，于CCA和頸內動脈(internal carotid artery，ICA)上各置一動脈夾，然后用顯微剪在ECA游離端剪一小口，將線栓由此插入動脈，去除ICA上的動脈夾，將線栓慢慢插入ICA，當線栓進入距ICA和ECA分叉處約18-19 mm有阻擋感時停止插栓，將松結結扎，去除CCA上的動脈夾，縫合皮膚。缺血2 h，拔除栓子，再灌注24 h。

2.3 腦血流監測 大鼠俯臥，頭部備皮，矢狀位剪開額頂部皮膚2 cm，暴露皮下筋膜，用浸滿雙氧水的棉簽摩擦暴露的筋膜，直至暴露出顱骨前囟及右側半顱骨，應用立體定位儀以前囟為起點向右5 mm，向后3 mm，在該處用牙科鉆打孔，至穿透顱骨但未打破硬腦膜為宜[6]。將激光多普勒血流監測儀探頭固定于孔上，開始記錄右側大腦中動脈供血區域血流變化值，當所示數值平穩，開始制作MCAO模型。動物入組標準為血流量下降至基線值的30%左右。

2.4 藥物干預 實驗組:MgSO4組于插栓缺血后20 min、30 min、40 min，分別給予25%MgSO4注射液160 mg/kg腹腔注射。對照組:每只大鼠在相應時點(每個時點包括2只大鼠)給予等體積生理鹽水腹腔注射。

2.5 神經功能缺損評價 于缺血2 h再灌注24 h后進行，參照Belayev等[7-10]12分評分法。(1)提尾懸空試驗:無明顯神經功能缺失為0分，梗死對側肢體屈曲為1分，梗死對側肢體外展為2分。(2)肢體放置試驗:?視覺試驗(前方):實驗者將動物握于手中，使其前爪懸空，自桌面斜上方向桌面緩慢靠近，此時桌子位于大鼠前方，正常大鼠反應為前肢即刻抓向桌面，損傷大鼠則表現為肢體反應延遲。正常為0分;反應延遲但不超過2 s為1分;反應延遲且超過2 s為2分。?視覺試驗(側方)，此時桌子位于動物側方，其余實驗方法及評分標準同前。?觸覺試驗(前方)，將動物雙眼遮住，并使其前爪懸空，此時大鼠應該既看不見，也不能用胡須觸及桌面，用其前爪背側輕觸桌面，刺激深度僅達到皮膚和毛發。動物反應及評分同視覺實驗。?觸覺試驗(側方)評分同前。?本體覺試驗，按壓動物前爪，刺激深達肌肉及關節，評分同前。

2.6 腦梗死體積測量[11]大鼠MCAO缺血2 h再灌注24 h后斷頭取腦(每組2只)，將鼠腦放在連續模具內進行冠狀等距切片，片厚約2 mm，共切6片，用2，3，5-氯化三苯基氯化四唑(2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)染色，攝片。使用Image-Pro Plus Analysis Software計算機圖像分析系統計算腦梗死體積。梗死體積百分率=(正常側大腦半球體積-梗塞側非梗塞區腦組織體積)/正常側大腦半球體積×100%。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料用均數±標準差()表示，t檢驗，組間比較采用方差分析和 LSD-t檢驗。

結 果

1 腦血流變化

如圖1A所示:對照組腦血流于再灌注開始即刻恢復至基線水平，整個再灌注階段血流不穩，呈現與心臟射血相應的搏動狀態。而圖1B-D顯示，硫酸鎂組的腦血流在再灌注開始時也立即出現，但是在再灌注全程中，腦血流呈現緩慢恢復趨勢，最終接近基線水平。如圖1E、F分別顯示了40 min給硫酸鎂治療組和對照組的全程腦血流變化情況。表1、圖1E、F顯示了缺血40 min硫酸鎂組處理組和對照組在缺血/再灌注全程的局部腦血流動態變化，各時點的比較均有明顯差異。

Figure1.Fluctuation of cerebral blood flow(CBF)in MCAO model.A:control;B:MgSO4treatment after 20 min ischemia;C:Mg-SO4treatment after 30 min ischemia;D:MgSO4treatment after 40 min ischemia;E:the whole ischemia/reperfusion process in MCAO model treated with MgSO4;F:the whole ischemia/reperfusion process in MCAO model without MgSO4treatment.Horizontal axis:time(minute);vertical axis:the relative value of CBF(PU);blue line:baseline;area 1:baseline CBF;area 2:CBF after filament inserted;area 3:CBF after MgSO4(Mg)or normal saline(NS)injection;area 4:restore CBF after filament removed.圖1 大腦中動脈阻塞缺血模型缺血2 h再灌注24 h的腦血流變化

表1 硫酸鎂處理組和對照組在不同時點平均腦血流量的動態變化Table1.Fluctuation of average local cerebral blood flow in MgSO4treatment group and control()

表1 硫酸鎂處理組和對照組在不同時點平均腦血流量的動態變化Table1.Fluctuation of average local cerebral blood flow in MgSO4treatment group and control()

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group Area 1 Area 2 Area 3 Area 4 Ischemia 40 min+MgSO4 127.65±17.50＊＊ 24.00±7.90* 45.00±7.50* 119.40±21.10＊＊265.67±78.90 Control 231.06±79.50 67.20±8.90 88.58±7.90

2 腦梗死體積及腦神經功能評分

硫酸鎂干預的3組的梗死體積(26.5%、36.5%和24.5%)明顯小于對照組的梗死體積(54%)。硫酸鎂組的神經功能缺損評分(5.670±1.003，8.670±1.211，7.170±1.472)明顯低于對照組(11.170±0.983)(P＜0.01)，硫酸鎂組與對照組比較差異顯著，見圖2、表2。

表2 缺血2 h后再灌注24 h大鼠腦梗死平均體積及神經功能缺損評分Table2.The average volume of cerebral infarction and the scores of neurological impairment after 2 h ischemia followed with 24 h of continuous reperfusion(.n=6)

表2 缺血2 h后再灌注24 h大鼠腦梗死平均體積及神經功能缺損評分Table2.The average volume of cerebral infarction and the scores of neurological impairment after 2 h ischemia followed with 24 h of continuous reperfusion(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group Infarction volume(%)Nervous score Ischemia 20 min+MgSO4 26.5 ±1.3＊＊ 5.670 ±1.003＊＊Ischemia 30 min+MgSO4 36.5 ±1.3＊＊ 8.670 ±1.211*Ischemia 40 min+MgSO4 24.5 ±2.1＊＊ 7.170 ±1.472＊＊Control 54.0 ±7.3＊＊11.170±0.983

Figure2.Brain slices with TTC staining.IS:ischemia.圖2 TTC染色腦片

討 論

自我保護機制是腦血管區別于其他器官血管的特征之一。當動脈血壓(arterial blood pressure，ABP)和腦灌注壓(cerebral perfusion pressure，CPP)在一定范圍內波動時，腦血管能夠自動調節，使腦血流量(cerebral blood flow，CBF)在一定范圍內保持相對穩定，這是腦血管的自動調節功能(cerebrolvascular autoregulation，CVA)[12-21]。長時間的缺血可以損害腦血管的自動調節功能，導致灌注恢復時發生腦水腫甚至腦出血等“灌注壓突破”現象。在急性缺血性卒中時CVA是否健全關系到能否維持腦血流量的穩定并保護腦組織，減輕再灌注損傷，因此對其進行評價非常必要。激光多普勒腦血流儀是一種連續、實時、微創和敏感的微循環血流監測技術，它不僅適用于皮膚微循環的血流監測和神經外科手術中局部腦血流量(regional cerebral blood flow，rCBF)的監測，近年來它更是應用于需要測定rCBF的基礎實驗研究中[6]。本研究用LDF監測動物模型的局部腦血流變化。

本研究使用的激光多普勒測速法，能反映微血管內血流的速度，由于微血管的管徑是不穩定的，所以當PU值降低時可能反映兩種情況，一是腦血管發生痙攣(血管管徑減小)，二是測量點血流量減少(腦組織灌注降低)。在本實驗中發現，硫酸鎂對缺血2 h后予以再灌注的大鼠，具有明顯腦血管自動調節功能的保護作用，減輕了拔栓模擬的缺血后血管再通導致的過度灌注損傷，最終有效減少了腦梗死體積，從而起到了腦保護作用。如圖1 A所示，我們截取了MCAO模型血流監測期拔栓前1 h及拔栓后20 min的圖片，MCAO大鼠在未給鎂保護的對照組，梗塞2 h后拔除栓子重建血流時，腦血流量即刻恢復至基線水平，再灌注5 min后，血流速度變化表現為明顯的與心臟射血節奏一致的大幅度波動，血管自動調節功能喪失，這種不穩定灌注狀態導致因過度灌注繼發的腦水腫，梗死面積擴大，甚至致死性的腦出血。因此再灌注期腦血管自動調節功能的維持至關重要。如圖1 B所示，截取了MCAO模型血流監測期拔栓前20 min及拔栓后15 min的圖片。給予硫酸鎂保護的大鼠，當拔除栓子，即刻血流并沒有恢復至基線血流，而是較拔栓前血流升高了1倍，是基線血流的70%左右，并且穩定維持這種灌注狀態約10 min之后血流開始逐漸升高，經歷了5 min左右逐漸恢復至基線水平，且灌注狀態穩定，沒有明顯波動，這說明此時腦血管的自動調節功能功能尚存。

以上的研究仍有不足之處，我們設置了3個給藥時點，希望觀察到什么時間之內給藥是有效的，但依據腦血流圖結果顯示，3個時點均有相似的血管保護功能，可以解釋為我們設置的時點過于緊湊，沒能很好的鑒別藥物干預失效的時間閾值。但不同給藥時點腦梗死體積有差異，尚無法解釋，未來需要進一步明確硫酸鎂對于腦血管自動調節功能保護作用的機制，以及在什么時間段內給予硫酸鎂治療能獲得最大的收益。

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