葛根素預(yù)處理對大鼠腦缺血早期腦組織eNOS的影響

谷翠芝，李清初，譚 寧，楊峻浩，盧慧玲，吳秋慧，容明智，黃嵐珍，馮飛玲

(桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

腦血管疾病是當(dāng)前導(dǎo)致人類死亡和殘障的主要原因之一，而且其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，其中80%左右為缺血性腦血管疾病。研究發(fā)現(xiàn)，急性腦缺血后，如能在腦血管栓塞后3 h內(nèi)(早期)，特別是在0.5 h(超早期)內(nèi)使腦血流恢復(fù)將大大降低病人的死亡率和致殘率[1]。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)合成一氧化氮(nitric oxide，NO)，能夠擴張腦血管，特別是在缺血半陰影區(qū)(ischemic penumbra，IP)，增加腦血流量對缺血的腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用[2]。葛根素(puerarin)是從葛根中提純分離得到的8－β－D－葡萄吡喃糖－4＇，7－二羥基異黃酮，能夠改善微循環(huán)，臨床上常用于治療心腦血管疾病，但其具體作用機制迄今仍未完全清楚。本研究采用多種實驗方法，探討葛根素對腦缺血早期的腦保護(hù)作用與腦組織eNOS表達(dá)的關(guān)系，為臨床應(yīng)用葛根素防治缺血性腦病提供參考依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠45只，SPF級，體重(269±25)g，由桂林醫(yī)學(xué)院動物中心提供。

1.2 藥品和試劑 注射用葛根素購于山東瑞陽制藥有限公司;兔抗eNOS多克隆抗體、免疫組化(DAB顯色)試劑購于武漢博士德生物技術(shù)公司。甲苯胺藍(lán)、Western blotting所需試劑購于USB和Sigma。

1.3 儀器 Olympus倒置相差顯微鏡及攝像系統(tǒng)由日本生產(chǎn)，小型垂直板凝膠電泳儀和電轉(zhuǎn)印跡儀美國生產(chǎn)，全自動凝膠成像分析儀購于上海培清科技有限公司。

2 方法

2.1 動物分組與模型制作 大鼠隨機分為假手術(shù)組(S組)、腦缺血組(M組)和葛根素預(yù)處理組(P組)。其中，P組和M組又分別分為腦缺血 0.5 h、1 h、2 h、4 h 4 個亞組，每組5 只。參照Longa等線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，用10%水合氯醛35 mg/kg ip麻醉，取頸前中線左旁0.2 cm處切口，用5號半靜脈針頭于頸總動脈(common carotid artery，CCA)刺一小口并插入線栓，插入深度為距CCA分叉處(19±1)mm，栓塞大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)。判斷動物模型制作成功的標(biāo)志之一是解剖大鼠時，在MCA起始部看見插入的線栓頭。S組除不插線，其余步驟同模型組。每組均在手術(shù)前10 min ip給藥，P組注射葛根素100 mg/kg，S組和M組注射等量生理鹽水。所有大鼠飲自來水，飼普通雞飼料，生活在晝夜節(jié)律為12 h、保持恒溫、恒濕的飼養(yǎng)間。

2.2 神經(jīng)功能缺損評分(5分法) 在腦缺血2 h和4 h，按照Longa 5分法評分標(biāo)準(zhǔn)，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分:0分:無神經(jīng)功能缺損;1分:提尾時右前肢內(nèi)收，不能完全伸展;2分:自發(fā)行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時身體向右側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走;5分:有意識喪失。評1分及以上者定為造模成功。

2.3 神經(jīng)尼氏體染色 采用改良的甲苯胺藍(lán)染色法。取近視交叉處石蠟塊切片，常規(guī)脫蠟至水，置1%甲苯胺藍(lán)水溶液(50－60℃)染色30 min，蒸餾水稍洗，95%乙醇分化約3 s，入酸化伊紅約3s，95%乙醇分化約3s，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光鏡下觀察神經(jīng)尼氏體變化。

2.4 免疫組化方法測定腦組織eNOS的表達(dá)和分布 取近視交叉處石蠟塊切片，用復(fù)合消化酶法進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加5%正常山羊血清封閉，用兔抗eNOS多克隆抗體(1∶50)孵育，DAB顯色。每張切片隨機選取5個位于腦皮層和海馬區(qū)的不互相重復(fù)的高倍視野，通過Image－Pro Plus圖像采集系統(tǒng)采圖，并運用該圖像處理軟件計算每個視野的光密度，取其平均值，分析比較各組大鼠eNOS的平均吸光度(absorbance，A)值。

2.5 Western blotting測定腦組織eNOS蛋白表達(dá) (1)蛋白提取:每組大鼠取腦組織前半部分切成小塊，用蛋白裂解液裂解、勻漿、離心，取上清液用考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)含量。(2)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳:制備10%分離膠和5%濃縮膠，電泳電壓100 V、30 min;當(dāng)染料移行到濃縮膠底線呈一直線時，調(diào)整電壓為200 V、100 min。(3)轉(zhuǎn)膜:依次鋪上海綿墊、4張濾紙、凝膠塊、硝酸纖維素膜、4張濾紙和另一海綿墊，夾緊轉(zhuǎn)印跡夾，接通電源，維持電壓150 V、80 min。(4)蛋白、抗體封閉:5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，兔抗eNOS多克隆抗體(1∶100)室溫下孵育1－2 h，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG稀釋液(1∶500)室溫下孵育1－2 h。(5)化學(xué)發(fā)光、顯影、定影:根據(jù)信號的強弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間。膠片經(jīng)掃描后，用凝膠圖像分析系統(tǒng)對蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行吸光度掃描，用條帶吸光度與內(nèi)參照(β－actin)條帶吸光度的比值來表示eNOS蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行處理。神經(jīng)功能缺損評分?jǐn)?shù)據(jù)為等級資料，采用非參數(shù)檢驗中的多個獨立樣本等級資料的檢驗(Kruskal－Wallis檢驗)及多重比較。其它資料均為計量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用完全隨機設(shè)計的方差分析(One－way ANOVA分析)，組間兩兩比較采用LSD－t法。檢驗水準(zhǔn)α=0.05(two－tailed)。

結(jié) 果

1 大鼠神經(jīng)功能變化

手術(shù)后麻醉清醒，M 2 h、M 4 h組大鼠神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)明顯重于P 2 h和P 4 h組，S組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。組間比較，差異顯著(P ＜0.01或 P ＜0.05)，見表1。

表1 葛根素預(yù)處理對大腦中動脈栓塞大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響Table1.Effects of puerarin pretreatment on neurological deficit scores after MCAO in rats

2 大鼠神經(jīng)元尼氏體變化

高倍鏡下，S組錐體細(xì)胞呈多邊形，突起明顯，尼氏小體和細(xì)胞核清晰可見，核居中，呈空泡狀，核仁淡藍(lán)色，胞質(zhì)見尼氏小體呈深藍(lán)色斑塊狀，分布量多，見圖1。M組隨著腦缺血時間延長，可見尼氏小體出現(xiàn)溶解，數(shù)量逐漸減少，M 4 h組錐體細(xì)胞腫脹、出現(xiàn)空泡變性，尼氏小體呈線狀、邊集。P組各亞組錐體細(xì)胞形態(tài)正常，腦缺血2 h內(nèi)神經(jīng)元尼氏體未見明顯溶解，腦缺血4 h細(xì)胞核周圍出現(xiàn)尼氏小體溶解，但程度很輕，未見空泡變性。

3 免疫組織化學(xué)檢測大鼠腦組織eNOS蛋白表達(dá)和分布的變化情況

染色結(jié)果顯示，eNOS蛋白主要表達(dá)在大鼠腦組織血管內(nèi)皮及中、小血管平滑肌細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，部分神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)中也有表達(dá)，陽性表達(dá)呈棕黃色或橙黃色。S組大鼠海馬及皮質(zhì)層微動脈和毛細(xì)血管內(nèi)皮表達(dá)不明顯。M組大鼠以M 1 h組eNOS表達(dá)增加明顯(P＜0.05或P＜0.01)，以缺血區(qū)周圍的皮質(zhì)中、小血管內(nèi)膜為主;P組大鼠eNOS表達(dá)均比對應(yīng)時點的M組增強(P＜0.01)，以缺血區(qū)周圍組織的血管為主。各組eNOS蛋白表達(dá)量見表2。

表2 葛根素預(yù)處理對腦缺血大鼠腦組織eNOS蛋白表達(dá)的影響Table2.Effects of puerarin pretreatment on eNOS protein expression in rat brain tissues injured by cerebral ischemia(.n=5)

表2 葛根素預(yù)處理對腦缺血大鼠腦組織eNOS蛋白表達(dá)的影響Table2.Effects of puerarin pretreatment on eNOS protein expression in rat brain tissues injured by cerebral ischemia(.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs S group;##P ＜0.01 vs M groups at the same time points.

Group eNOS protein expression S 0.1589 ±0.0019 M 0.5 h 0.1683 ±0.0068 M 1 h 0.3375 ±0.0206＊＊M 2 h 0.3157 ±0.0446＊＊M 4 h 0.2744 ±0.0504*P 0.5 h 0.3737 ±0.0175##P 1 h 0.5240 ±0.0719##P 2 h 0.6682 ±0.0596##P 4 h 0.6512 ±0.0714##

Figure1.Neuron Nissl body staining(×640).A:sham－operated group;B1:cerebral ischemia 0.5 h group;B2:cerebral ischemia 1 h group;B3:cerebral ishemia 2 h group;B4 cerebral ischemia 4 h group;C1:puerarin pretreatment and cerebral ischemia 0.5 h group;C2:puerarin pretreatment and cerebral ischemia 1 h group;C3:puerarin pretreatment and cerebral ischemia 2 h group;C4:puerarin pretreatment and cerebral ischemia 4 h group.圖1 神經(jīng)元尼氏體染色

4 Western blotting方法檢測大鼠腦組織eNOS蛋白表達(dá)變化情況

S組大鼠腦組織eNOS蛋白表達(dá)很少;M組中，以M 1 h組eNOS蛋白表達(dá)最高(P＜0.05)，而M 0.5 h組表達(dá)很少;P組eNOS蛋白表達(dá)均明顯高于對應(yīng)時點的M組(P＜0.05);各組eNOS表達(dá)結(jié)果見圖2。

Figure2.Analysis of eNOS protein expression in brain tissues of rats in sham －operated group(S)，cerebral ischemia group(M)，puerarin pretreatment group(P).A:data from Western blotting for eNOS protein;B:relative expression of eNOS protein.＊＊P ＜0.01 vs S group;#P＜0.05，##P ＜ 0.01 vs M groups at the same time points.圖2 假手術(shù)組、腦缺血組和葛根素預(yù)處理組大鼠腦組織eNOS蛋白質(zhì)表達(dá)的比較

討 論

缺血性腦卒中又稱為腦梗死，是各種原因?qū)е碌哪X動脈血流中斷，局部腦組織發(fā)生缺血缺氧性壞死而引發(fā)的相應(yīng)神經(jīng)功能缺損。由于腦組織的氧、葡萄糖和糖原儲備甚微，血流一旦完全阻斷，數(shù)分鐘內(nèi)即可出現(xiàn)能量代謝和離子平衡紊亂。因此，在有效防治缺血性腦損傷的研究中，人們很重視盡早改善腦血流供應(yīng)。NO是腦內(nèi)重要的信號分子，由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化精氨酸產(chǎn)生;低濃度的NO可活化可溶解性鳥苷酸環(huán)化酶，促進(jìn)cGMP產(chǎn)生，使血管平滑肌細(xì)胞松弛，增加腦血流量，并抑制谷氨酸釋放產(chǎn)生腦保護(hù)作用[3];高濃度的NO促進(jìn)谷氨酸釋放，并可與自由基作用產(chǎn)生毒性更強的ONOO－和·OH。NOS依據(jù)組織類型分為3種:eNOS、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)。nNOS和eNOS是Ca2+－鈣調(diào)蛋白依賴性酶，在生理狀態(tài)下就有表達(dá);iNOS為非鈣離子依賴性酶，正常情況下不表達(dá)，僅在脂多糖及許多細(xì)胞因子刺激下才表達(dá)。其中，nNOS和iNOS催化NO產(chǎn)生的作用強烈、持久，而eNOS的作用相對溫和短暫[4]。在MCAO后，eNOS基因缺陷鼠腦IP的腦血流量較野生鼠減少，而缺血中心區(qū)的梗死范圍更大，這表明eNOS基因表達(dá)在IP的血管擴張中起著關(guān)鍵作用[5]。

葛根素的腦保護(hù)作用已在臨床應(yīng)用中被證實，對它的腦保護(hù)作用機制也有許多研究。如實驗發(fā)現(xiàn)葛根素可抑制腦缺血大鼠海馬nNOS的表達(dá)[6];葛根素預(yù)處理可降低缺血再灌注大鼠腦組織的NO水平和細(xì)胞間黏附分子－1(intercellular adhesion molecule－1，ICAM －l)蛋白、mRNA 表達(dá)及核因子 － κB(nuclear factor－ κB，NF － κB)065 亞基核轉(zhuǎn)位[7，8];羥乙葛根素可降低缺血再灌注大鼠腦組織的總NOS和iNOS活力[9];葛根素還能降低血管性癡呆大鼠海馬的低氧誘導(dǎo)因子－1α和紅細(xì)胞生成素的表達(dá)，這一結(jié)果間接證明了它可促進(jìn)缺血腦組織的血流灌注、提高缺血區(qū)氧濃度[10];更有證據(jù)直接顯示葛根素能增加腦及冠狀動脈的血流量[11]。本實驗中，P組大鼠腦組織eNOS表達(dá)均比M組明顯增強(表2和圖2)，大鼠神經(jīng)功能缺損和海馬錐體細(xì)胞損傷卻明顯輕于M組。最重要的是，在腦缺血0.5h，P組大鼠腦組織IP血管的eNOS表達(dá)明顯增強，而且eNOS表達(dá)增強的持續(xù)時間延長;M組在此時段eNOS表達(dá)增加不明顯。由此推測，葛根素預(yù)處理對大鼠腦缺血的腦保護(hù)作用與它在腦缺血后快速上調(diào)腦組織eNOS的表達(dá)有關(guān)。臨床研究還發(fā)現(xiàn)，葛根素治療能升高腦梗死患者血清中的血管內(nèi)皮生長因子和NO水平，減輕腦梗死后延遲再損傷，縮小腦梗死體積，減輕腦水腫，改善神經(jīng)功能[12]。

此外，eNOS還能抑制血管收縮反應(yīng)和腦血管痙攣，能影響血腦屏障內(nèi)皮組織的滲透性[13]。在卒中的小鼠試驗中發(fā)現(xiàn)，eNOS能促進(jìn)血管平滑肌增殖和遷移，增大腦血管的密度和直徑，促進(jìn)卒中后的腦側(cè)支循環(huán)建立[14];eNOS缺陷可損害神經(jīng)信號傳導(dǎo)和卒中后的神經(jīng)生長[15]。本研究顯示葛根素可在腦缺血后的短時間內(nèi)促進(jìn)腦組織eNOS蛋白的表達(dá)，從多層面產(chǎn)生腦保護(hù)作用。

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