慢性阻塞性肺疾病中轉錄因子ATF3/ATF4與Nrf2的表達及相互作用*

劉曉燕， 戴愛國， 譚雙香

(1湖南省老年醫院－老年醫學研究所呼吸疾病研究室，湖南 長沙 410016;2南華大學研究生院，湖南 衡陽 421001)

轉錄因子ATF3/ATF4屬于ATF/CREB轉錄因子家族，富含堿性亮氨酸拉鏈結構(basic leucine zippe，bZIP)，廣泛參與多種病理生理過程，如氧化應激、細胞凋亡和免疫調節等。紅系衍生的核因子相關因子2(NF－E2－related factor 2，Nrf2)作為體內重要的轉錄激活因子，對氧化應激狀況下多種抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達起著重要的調控作用，可有效緩解氧化損傷［1］。近來研究證實［2，3］，ATF3 和ATF4可協同Nrf2調控抗氧化反應元件(anti－oxidant response element，ARE)依賴的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達，如γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基(glutamyl－L－cysteine ligasecatalytic subuint，GCLC)、谷胱甘肽S轉移酶(glutathione S－transferase，GST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase－1，HO－1)等。我室前期研究發現ATF3和ATF4在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)大鼠肺組織中表達明顯增強［4］，但在 COPD患者中它們的研究較少。本實驗擬通過觀察ATF3、ATF4和Nrf2在COPD患者中表達情況的變化，初步探討ATF3、ATF4與Nrf2之間的相互作用以及它們在COPD氧化/抗氧化失衡中的可能作用。

材料和方法

1 材料

芙蓉牌香煙(湖南中煙工業公司，尼古丁1 mg/支，焦油 14 mg/支);脂多糖(LPS)Sigma;ATF3、ATF4、Nrf2兔多克隆抗體均購自Santa Cruz;SP免疫組化試劑盒、ATF3、ATF4、Nrf2原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;RIPA總蛋白提取試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、protein A+G agarose及ECL化學發光劑均購自江蘇碧云天生物技術研究所;BCA法蛋白質含量檢測試劑盒購自南京凱基生物發展有限公司;蛋白電泳系統為Bio－Rad產品;小動物肺功能測定系統:HX200型呼吸流量換能器(北京新行興業科貿有限公司)。

2 方法

2.1 動物模型復制及組織標本制備 成年雄性SD大鼠22只(湖南中醫學院動物部提供，清潔級)，平均體重(240±20)g，鼠齡10周，按隨機數字表法分COPD組和對照組，每組11只。用每日熏香煙，其中第1 d、14 d氣管內滴LPS(1g/L)200 μL建立COPD大鼠模型［5］;對照組第1和14 d氣管內注入生理鹽水200 μL，其余不作任何干預，兩組飼養條件相同。COPD模型組在第4 d死亡1只，原因不明。第28 d熏香煙后，兩組大鼠均用1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，操作步驟參照我室方法［5］用小動物肺功能測定儀測定大鼠0.3 s用力呼氣容積(forced expiratory volume in first 0.3 s，FEV0.3)、0.3 s用力呼氣容積占用力肺活量的比值(percentage of forced ecpiratory volume in first 0.3 s to forcedvital capacity，FEV0.3/FVC)、呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)，2 h內將大鼠大動脈放血處死，取右肺置于液氮中保存用于免疫共沉淀(co－immunoprecipitation，Co－IP)分析。

2.2 臨床組織標本留取 肺組織標本來自湖南省腫瘤醫院胸外科2008年12月－2009年12月因早期肺癌行肺葉切除術者40例，所有患者術前均詢問病史，進行體檢、X線胸片或肺部CT和肺功能檢測。COPD組20例:男15例，女5例，平均年齡(61±5)歲，臨床診斷符合中華醫學會呼吸病學分會2007年制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》標準［6］。第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(percentage of forced expiratory volume in one second to predicted value，FEV1%pred)為(69.60±4.45)%，第1秒用力呼氣容積/用力肺活量(percentage of forced expiratory volume in first second to forced vital capacity，FEV1/FVC)為(66.46±3.00)%。肺標本右下肺12例，左下肺8例。對照組20例:男17例，女3例，平均年齡(59±6)歲，FEV1%預計值為(84.95±3.69)%，FEV1/FVC為(83.15±3.40)%。肺標本右下肺9例，左下肺11例。兩組年齡、性別及取材部位比較差異無顯著(均 P＞0.05)，FEV1%預計值、FEV1/FVC比較差異顯著(均P＜0.01)。受檢者均排除合并患有心、肝、腎等其它疾病，并排除支氣管擴張癥、肺結核和其它可以影響肺功能的疾病。參照文獻［7］取材，標本取材均遠離癌組織5 cm以上，將肺組織于4%多聚甲醛(含1‰ DEPC)中固定，常規石蠟包埋、切片、保存，行免疫組化和原位雜交檢測各指標的表達。

2.3 免疫組化檢測 操作步驟按SP染色試劑盒說明書操作，Ⅰ抗用PBS稀釋(稀釋比例分別為ATF31∶50;ATF41∶50;Nrf21∶50)，孵育Ⅰ抗均采取 4 ℃過夜。DAB顯色，蘇木精復染，陽性結果顯棕黃色。用顯微顯影系統(Olympus)采集和分析圖像:為了便于比較，隨機選擇內徑為100－200 μm的細支氣管和肺泡區各3個視野(×200)以JD系列病理圖文形態分析系統(江蘇省捷達科技發展有限公司)測量并計算陽性信號平均吸光度(A)值，取平均值作為每個樣本陽性表達的相對強度。

2.4 原位雜交檢測 地高辛標記的多相寡核苷酸探針序列:ATF3 mRNA:(1)5'－CAGAA CAAGC ACCTC TGCCA CCGGA TGTCC TCTGC － 3'，(2)5'－TACAT GCTCA ACCTT CATCG GCCCA CGTGT ATTGT－3'，(3)5'－TTTAT CCAAC AGATA AAAGA AGGAA CATTG CAGAG－3';ATF4 mRNA:(1)5'－GATTG GATGT TGGAG AAAAT GGATT TGAAG GAGTT－3'，(2)5'－GATGA CACTT GTGAT CTCTT TGCCC CCCTA GTCCA －3'，(3)5'－ AGGTA CCGCC AGAAG AAGAG GGCGG AGCAG GAGGC－3';Nrf2 mRNA:(1)5'－AGCAG GACAT GGAGG AAGTT TGGCA GGAGG TATTT －3'，(2)5'－ GTAAA GCTTT CAACC AGAAG CACAC TGAAG GCACG － 3'，(3)5'－ATGAC TTCAA TGAAA TGATG TCCAA GGAGC AATTC－3'。操作步驟按原位雜交試劑盒使用說明書進行，DAB顯色，蘇木素復染。檢測方法同上。

2.5 免疫共沉淀檢測 于液氮中取出大鼠肺組織按照RIPA總蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。冰上裂解30 min，4℃12000×g離心5 min，收集上清，加入捕獲抗體(Nrf21∶200)，4 ℃輕搖孵育24 h，再加入20 μL protein A+G agarose，4℃緩慢搖動2 h沉淀抗體結合復合物。4℃、2500×g離心5 min棄上清，加入PBS重懸洗滌3次，再加入適量1×SDS－PAGE電泳上樣緩沖液煮沸5 min，離心取上清，上樣，12%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白后，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用ATF3抗體(1∶200)、ATF4抗體(1∶200)室溫下搖床孵育2 h，Ⅱ抗(1∶10000稀釋)室溫孵育1 h，最后用ECL化學發光法膠片成像。

3 統計學處理

結 果

1 大鼠肺功能及肺組織的病理改變

COPD組 大 鼠 FEV0.3、FEV0.3/FVC和 PEF［(2.25 ±0.14)mL、(62.09 ±1.30)% 和(20.60±1.88)mL/s］較對照組［(4.05 ± 0.24)mL、(81.10±1.82)% 和(39.48±2.77)mL/s］顯著降低(均P＜0.01);光鏡下觀察肺組織病理改變:與對照組比較，COPD組大鼠支氣管肺內出現炎癥細胞浸潤，上皮層、平滑肌層增厚;支氣管黏膜增厚、脫落，基底細胞排列紊亂，腺體增生肥大;終末細支氣管遠端的氣囊腔膨脹擴大，肺泡壁變薄，部分肺泡破裂融合成肺大泡，符合中華醫學會2007年制定的標準［6］。

2 肺組織ATF3、ATF4和Nrf2 mRNA的表達

原位雜交結果(圖1)顯示:ATF3、ATF4和Nrf2 mRNA在2組患者肺組織中的表達部位基本一致，主要見于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、平滑肌細胞血管內皮細胞以及炎癥細胞中。ATF3、ATF4 mRNA在COPD組均顯著高于對照組(均P＜0.01)，兩組Nrf2 mRNA比較無明顯差異(P＞0.05)，見表1。

3 肺組織中ATF3、ATF4和Nrf2蛋白的表達

免疫組化光鏡下見ATF3、ATF4、Nrf2蛋白主要表達于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、炎癥細胞，小血管平滑肌中亦有少許表達，胞漿胞核均有免疫著色，以胞核表達為主，見圖2。ATF3、ATF4、Nrf2蛋白在COPD組均呈陽性表達且顯著高于對照組(均P ＜0.01)，見表1。

4 Nrf2與ATF3、ATF4的相互作用

免疫共沉淀結果顯示ATF3、ATF4與Nrf2可雜交出明顯的蛋白條帶，見圖3，且COPD組顯著高于對照組(P ＜0.05)，提示 Nrf2與 ATF3、ATF4之間存在相互作用。

Figure 1.The expression of ATF3，ATF4 and Nrf2 mRNA in lung tissues of patients in each group(in situ hybridization，DAB，×200).A，C，E:control;B:ATF3 in COPD group;D:ATF4 in COPD group;F:Nrf2 in COPD group.圖1 兩組患者肺組織中ATF3、ATF4和Nrf2 mRNA的表達

Figure 2.The expression of ATF3，ATF4 and Nrf2 proteins in lung tissues of patients in each group(immunohistochemistry，DAB，×200).A，C，E:control;B:ATF3 in COPD group;D:ATF4 in COPD group;F:Nrf2 in COPD group.圖2 兩組患者肺組織中ATF3、ATF4和Nrf2蛋白的表達

表1 兩組COPD患者肺組織ATF3、ATF4、Nrf2 mRNA及蛋白的表達Table 1.The mRNA and protein expression of ATF3，ATF4 and Nrf2 in control patient and COPD patient lung specimens(.n=20)

表1 兩組COPD患者肺組織ATF3、ATF4、Nrf2 mRNA及蛋白的表達Table 1.The mRNA and protein expression of ATF3，ATF4 and Nrf2 in control patient and COPD patient lung specimens(.n=20)

＊＊P ＜0.01 vs control group.ISH:in situ hybridization;IHC:immunohistochemistry.

Group ATF3 ATF4 Nrf2 ISH IHC ISH IHC ISH IHC Control 0.18 ±0.06 0.20 ±0.04 0.17 ±0.05 0.19 ±0.04 0.16 ±0.04 0.20 ±0.05 COPD 0.31 ±0.05＊＊ 0.34 ±0.07＊＊ 0.25 ±0.05＊＊ 0.32 ±0.08＊＊ 0.18 ±0.03 0.37 ±0.07＊＊

Figure 3.Interactions of ATF3/ATF4 protein and Nrf2 protein in the rat lungs determined by co－immunoprecipitation..n=11.*P＜0.05 vs control group.圖3 免疫共沉淀檢測大鼠肺組織中Nrf2與ATF3、ATF4的相互作用

討 論

氧化失衡是COPD重要發病機制之一。機體在各種氧化應激狀況下，體內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增加，超出了抗氧化物質的清除能力，導致氧化/抗氧化失衡，從而造成肺部損傷，氣流受限進行性加重。近年發現，Nrf2是氧化應激反應中的重要轉錄激活因子，并在COPD的發生發展中起著重要作用［8］。在靜息狀態下，Nrf2主要與 Keap1結合以失活的形式定位于胞漿;氧化應激時Keap1失活而Nrf2通過各種信號通路激活移位入核，與其它bZIP因子如Jun、ATF4、小Maf蛋白等形成異二聚體結合于其下游的靶基因如γ－GCS、HO－1、NAD(P)H:醌氧化還原酶1［NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1］等基因調控序列的ARE上發揮轉錄調控作用［1，9］。本實驗發現雖然Nrf2蛋白在COPD組表達明顯上調，以核內表達為主;但Nrf2 mRNA在2組表達無顯著差異。考慮氧化應激狀態下，Nrf2與負調控子Keap1解離，Nrf2降解減少，蛋白穩定性增加，激活的Nrf2移位入核影響其蛋白表達水平，進而在核內發揮上調抗氧化基因表達的作用［5，10，11］。但目前對于 Nrf2 的轉錄調控機制涉野較少，進一步研究有助于為COPD的抗氧化失衡機制提供有力的理論依據及實踐意義。

近來研究發現，氧化應激狀況下，轉錄因子ATF3基因缺失可導致體內重要抗氧化物質谷胱甘肽(glutathione，GSH)合成減少，同時可降低Nrf2下調ROS的水平，增加DNA損傷;但ATF3基因缺失并不影響Nrf2對其下游靶基因如HO－1、硫氧還蛋白1(sulfiredoxin 1，SRXN1)、NQO1 等的轉錄調控［11］。由此表明高表達的ATF3需與Nrf2相互作用，增強Nrf2對靶基因轉錄調控的活性，從而降低機體氧化損傷。本研究結果顯示ATF3蛋白及 mRNA在COPD組均較對照組顯著增高，胞核表達為主，且其表達部位與Nrf2蛋白及mRNA表達部位基本一致，提示在COPD氧化應激狀況下，ATF3表達反應性明顯上調，且其基因表達與Nrf2轉錄密切相關。Kim等［12］在研究中證實 ATF3啟動子區域具有 ARE，Nrf2通過與之結合，從而調節ATF3基因表達。同時本研究中，免疫共沉淀顯示以Nrf2抗體捕獲的免疫沉淀中，ATF3抗體可雜交出明顯的蛋白條帶，并且這種結合在COPD組明顯增強，從而證實Nrf2與ATF3蛋白之間存在直接相互作用。據以往報道，ATF3常常通過其bZIP區域與Nrf2形成異二聚體調控抗氧化基因表達，如 GCLC、GST等［2］。因此綜合以上研究成果，我們推測氧化應激時ATF3表達上調，通過與核轉位的Nrf2形成異二聚體，增強Nrf2的結合活性，可能轉錄調控Nrf2下游抗氧化酶基因的表達，在COPD氧化/抗氧化失衡中發揮作用，但其中的具體機制還有待于進一步研究。

氧化應激目前是人類多種疾病重要的發病機制之一，胞內氧化應激的精確調節主要是通過應激反應轉錄因子家族。既往研究表明，在氧化應激下，ROS產生增多可活化PERK/eIF2α/ATF4通路，促進GSH的合成，對細胞發揮保護性作用［13］。本實驗結果顯示ATF4蛋白及mRNA在COPD組均較對照組顯著增高，以胞核表達為主，證實在氧化應激狀況下，ATF4表達上調參與維持體內氧化/抗氧化平衡。然而應激狀況下ATF4表達上調的調控機制究竟如何呢?Afonyushkin等［14］發現，這其中包括兩個平行機制:(1)依賴于Nrf2與ATF4基因啟動子區域ARE相結合的方式上調ATF4 mRNA水平;(2)與此相伴隨的是通過PERK途徑，eIF2α磷酸化，增強ATF4蛋白的合成。在本組實驗中，我們也發現，ATF4表達部位與Nrf2蛋白及mRNA表達部位基本一致，佐證了Nrf2對ATF4表達的轉錄調控作用。值得注意的是，ATF4和Nrf2之間是否還存在其它關聯?以往研究顯示［3］，ATF4能增強Nrf2的轉錄調控活性，形成ATF4·Nrf2異二聚體結合于抗氧化酶HO－1應激反應元件(stress response element，StRE)上，調控HO－1的表達。本研究利用Co－IP技術，顯示在ATF4與Nrf2蛋白之間存在直接相互作用關系，且COPD組明顯增強。由此我們推測，應激狀況下ATF4可協同Nrf2對其下游靶基因發揮轉錄調控作用，調節細胞的氧化還原能力，從而對抗氧化損傷。

總之，我們的研究表明，在COPD的發病過程中，轉錄因子ATF3、ATF4與Nrf2形成異二聚體，可能參與對下游抗氧化酶基因表達的調控，在COPD的氧化失衡機制中發揮重要的生物學作用，進一步的深入研究可能會為COPD的防治提供新的途徑。

［1］Goven D，Boutten A，Le?on － Malas V，et al.Altered Nrf2/Keapl－Bach1 equilibrium in pulongary emphysema［J］.Thorax，2008，63(10):916 －924.

［2］Bakin AV，Stourman NV，Sekhar KR，et al.Smad3－ATF3 signaling mediates TGF－β suppression of genes encoding phase II detoxifying proteins［J］.Free Radic Biol Med，2005，38(3):375 －387.

［3］He CH，Gong P，Hu B，et al.Identification of activating transcription factor 4(ATF4)as an Nrf2－interacting protein.Implication for heme oxygenase－1 gene regulation［J］.J Biol Chem，2001，276(24):20858－20865.

［4］劉曉燕，戴愛國，李 潔.轉錄因子ATF3和ATF4在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的表達及作用［J］.中國呼吸與危重監護雜志，2011，10(2):121 －125.

［5］王梅芳，戴愛國，胡瑞成，等.轉錄因子Nrf2/Bachl及MAPK激酶調控γ－GCS在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的作用［J］.中國病理生理雜志，2009，25(5):959－964.

［6］中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)［J］.中華結核和呼吸雜志，2007，30(1):8 －17.

［7］林書典，戴愛國，徐 平.慢性阻塞性肺疾病患者γ谷氨酰半胱氨酸合成酶活性及表達的變化［J］.中華結核和呼吸雜志，2005，28(2):97 －101.

［8］Adair KT，Atkinson JJ，Griffin GL，et al.Distal airways in mice exposed to cigarette smoke:Nrf2－regulated genes are increased in Clara cells［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2008，39(4):400 －411.

［9］Kensler TW，Wakabayashi N，Biswal S.Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1－2－ARE pathway［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2007，47:89–116.

［10］McMahon M，Itoh K，Yamamoto M，et al.Keapl－dependent proteasomal degradation of transcription factor Nrf2 contributes to the negative regulation of antioxidant response element－ driven gene expression［J］.J Biol Chem，2003，278(24):21592 －21600.

［11］Hsieh TC，Lu X，Wang Z，et al.Induction of quinone reductase NQO1 by resveratrol in human K562 cells involves the antioxidant response element ARE and is accompanied by nuclear translocation of transcription factor Nrf2［J］.Med Chem，2006，2(3):275 －285.

［12］Kim KH，Jeong YJ，Surh YJ，et al.Expression of stress－ response ATF3 is mediated by Nrf2 in astrocytes［J］.Nucleic Acids Res，2010，38(1):48 －59.

［13］Malhotra JD，Kaufman RJ.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress:a vicious cycle or a double－edged sword?［J］.Antioxid Redox Signal，2007 ，9(12):2277－2293.

［14］Afonyushkin T，Oskolkova OV，Philippova M，et al.Oxidized phospholipids regulate expression of ATF4 and VEGF in endothelial cells via NRF2－dependent mechanism:novel point of convergence between electrophilic and unfolded protein stress pathways［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010 ，30(5):1007 － 1013.