辛伐他汀對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞分泌趨化因子的影響及其機制*

陳偉玲， 梁柳琴， 邱 茜， 葉玉津， 詹鐘平

(中山大學附屬第一醫院風濕免疫內科，廣東 廣州 510080)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關節滑膜慢性炎癥和關節破壞為主要特點的系統性自身免疫性疾病，但發病機制尚不清楚［1］。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)及其分泌的炎癥細胞因子在RA滑膜炎的發生和發展中具有關鍵性的作用。目前已在RA關節滑膜組織和滑液中檢測到多種趨化因子。趨化因子除促進外周血白細胞遷徙至關節組織內外，還對滑膜細胞活化、細胞增殖和血管新生具有重要的調節作用［2］，因此，趨化因子很可能是RA治療的新靶點。FLS和單核巨噬細胞是分泌趨化因子的主要細胞［2，3］。

近年研究發現，他汀類降脂藥除有降脂作用外，還具有抗炎和免疫調節作用［4，5］。愈來愈多的證據表明，他汀類藥物對類風濕關節炎等自身免疫性疾病具有治療作用。多個臨床研究發現，他汀類藥物能顯著改善RA患者癥狀和疾病活動程度［6-8］。動物實驗也證實該類藥物能抑制關節炎癥和破壞［9，10］。但他汀類藥物治療RA的確切機制仍未完全清楚。為此，本文將觀察在RA患者FLS中，經典的他汀類藥物辛伐他汀(simvastatin，SMV)對類風濕關節炎FLS分泌趨化因子的影響，并進一步探討其信號調控機制。

材料和方法

1 研究對象

17例RA患者均符合美國風濕病學會(American College of Rheumatology，ACR)1987年類風濕關節炎診斷標準［11］，其中女性15例，男性2例，除3名患者外，其他患者均用過激素(≤10 mg/d)和慢作用藥物，但均未用過生物制劑。

2 FLS分離和培養

滑膜組織取自行關節鏡和關節置換的RA患者。無菌條件下，將滑膜組織移至60 mm培養皿中，用眼科剪將其剪成碎屑，加入1g/L I型膠原酶，充分混勻后將其置于37℃、5%CO2的細胞培養箱孵育4-6 h。用孔直徑約為10 μm的細胞篩網(每個)過濾碎屑，濾過的液體轉移至15 mL離心管中;常溫下離心5 min，吸去上清，加入 5 mL含 20%FBS的DMEM/F12培養基，并轉移至細胞培養瓶中培養。約24 h后FLS黏附于培養瓶壁上，此時可換成含10%FBS的DMEM/F12培養基培養。用第3-5代的細胞進行實驗。根據實驗需要，分別用辛伐他汀(1 μmol/L)、腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor，TNF-α，10 μg/L)、HMG-CoA 途徑代謝產物甲羥戊酸(mevalonate，MEVA，200 μmol/L)和焦磷酸香葉基香葉酯 (geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP，10 μmol/L)及 C3轉移酶(C3-transferase，一種 RhoA抑制劑，20 mg/L)處理FLS。同時，用臺盼藍拒染法檢測細胞活性，細胞活性超過95%。

3 提取細胞總蛋白

用冷1×PBS洗滌細胞1次，加入50 μL SDS樣本裂解緩沖液A［50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，10 mmol/L MgCl2，500 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，0.5%去氧膽酸鈉，0.1%SDS，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，10 mg/L亮抑肽酶，10 mg/L抑肽酶］，勻漿后置冰上，超聲粉碎10-15 s，于95-100℃煮5 min，然后置冰上;4℃ 12000 r/min離心5 min，吸取上清，分裝儲存于-20℃。

4 RhoA活性檢測

采用pull-down方法檢測。把培養的各組類風濕關節炎FLS用裂解緩沖液A于冰上裂解，離心后把等體積的細胞裂解物上清與20 μg GST-RBD珠(Upstate)于4℃孵育45 min，然后用Tris緩沖液洗滌3次。把已與Rho蛋白結合區域(Rho-binding domain，RBD)結合的珠用RhoA單抗經免疫印跡法檢測。

5 免疫印跡法

把樣品蛋白于95-100℃煮5 min，然后等量上樣于15%SDS-PAGE凝膠上進行電泳，開始電壓為90 V，溴酚藍進入分離膠層時調至120 V，待溴酚藍接近至凝膠底部時停止電泳［電泳緩沖液為1×Tris-甘氨酸緩沖液(pH7.9)］，用轉移緩沖液把凝膠上蛋白質轉移至醋酸纖維膜上，膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，然后膜與不同濃度Ⅰ抗(RhoA 為1∶500，β -肌動蛋白為 1∶2000，均購自Santa Cruz)于4℃孵育過夜，接著膜在室溫下與Ⅱ抗(為辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG，1∶2000，購自Santa Cruz)孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液顯影，最后將結果進行圖像分析，計算吸光度(A)值。

6 細胞活性測定

FLS活性采用四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法測定。為檢測細胞活性，將實驗分為4組:單獨無血清培養基培養組、TNF-α組、TNF-α +1 μmol/L SMV 組、TNF- α +20 mg/L C3轉移酶，每組均設3個復孔。把1×104類風濕關節炎FLS在含100 μL培養液的96孔組織培養板中培養72 h，用前列腺素(prostaglandin，PG)刺激前先用C3轉移酶預處理細胞3 h。MTT比色法具體步驟參見文獻［12］。

7 趨化因子濃度檢測

FLS培養上清 IL-8和單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)分泌水平用ELISA方法檢測，按廠家提供的步驟進行操作。

8 統計學處理

結 果

1 辛伐他汀對TNF－α誘導的趨化因子分泌的影響

如圖1所示，未經刺激的FLS僅分泌微量IL-8和 MCP-1，用 TNF-α(10 μg/L)刺激 24 h 后，FLS分泌上述趨化因子顯著增加。辛伐他汀顯著抑制TNF-α誘導的IL-8和MCP-1分泌，而且辛伐他汀的這種抑制作用可被HMG-CoA途徑代謝產物MEVA和GGPP逆轉。

Figure 1.Inhibitory effect of simvastatin on TNF-α-induced secretion of IL-8(A)and MCP-1(B)in RA FLS..n=5.*P ＜0.05 vs basal;#P ＜0.05 vs TNF-α;△P＜0.05 vs TNF-α +SMV.SMV:simvastatin;MEVA:mevalonate;GGPP:geranylgeranyl pyrophosphate.圖1 辛伐他汀對TNF－α誘導類風濕關節炎FLS IL－8和MCP－1分泌的影響

2 辛伐他汀對TNF－α誘導的RhoA活性的影響

如圖2所示，用 TNF-α(10 μg/L)刺激體外培養的FLS 15 min，與只用無血清培養基孵育的未刺激組比較，其RhoA活化顯著增強，而總RhoA蛋白表達未受影響。辛伐他汀顯著抑制TNF-α誘導的RhoA活化，而辛伐他汀的這種抑制作用也能被MEVA和GGPP逆轉。

3 RhoA抑制劑對類風濕關節炎 FLS分泌趨化因子的影響

為探討RhoA通路是否參與調控TNF-α誘導的趨化因子分泌，我們分別用RhoA特異性抑制劑C3轉移酶(20 mg/L)與FLS預孵育3 h，然后用TNF-α(10 μg/L)刺激24 h。如圖3所示，RhoA抑制劑C3酶對TNF-α誘導的IL-8和MCP-1分泌具有明顯抑制作用。

Figure 2.Inhibitory effect of simvastatin on TNF-α-induced activation of RhoA in RA FLS..n=5.*P＜0.05 vs basal;#P ＜0.05 vs TNF-α;△P ＜0.05 vs TNF-α +SMV.SMV:simvastatin;MEVA:mevalonate;GGPP:geranylgeranyl pyrophosphate.圖2 辛伐他汀對TNF－α誘導類風濕關節炎FLS RhoA活性的影響

Figure 3.Inhibitory effect of RhoA inhibitor on TNF-α-induced secretion of IL-8(A)and MCP-1(B)in RA FLS..n=5.*P＜0.05 vs basal;#P＜0.05 vs TNF-α.C3:C3-transferase.圖3 RhoA抑制劑對類風濕關節炎 FLS分泌IL－8和MCP－1的影響

4 辛伐他汀和RhoA抑制劑對類風濕關節炎FLS活性的影響

如圖4所示，辛伐他汀(1 μmol/L)、RhoA 特異性抑制劑C3轉移酶(20 mg/L)作用于FLS 24 h后其細胞活性沒有顯著影響。

Figure 4.Effect of simvastatin and RhoA inhibitor on RA FLS viability..n=5.*P＜0.05 vs basal.C3:C3-transferase;SMV:simvastatin.圖4 辛伐他汀和RhoA抑制劑對類風濕關節炎FLS活性的影響

討 論

辛伐他汀是一種廣泛使用的經典降脂藥，近年發現其具有抗炎和免疫調節作用。動物實驗和臨床研究提示，辛伐他汀對RA有較好的治療效果［6-10］，但其確切的作用機制仍有待闡明。

以往研究發現，在單核細胞和血管平滑肌細胞中，阿托伐他汀顯著抑制血管緊張素Ⅱ和TNF-α誘導的 MCP-1 和 IL-8 分泌［13，14］。本文發現，辛伐他汀顯著抑制TNF-α刺激的類風濕關節炎 FLS分泌IL-8和MCP-1等趨化因子分泌，而且這種抑制作用可被MEVA和GGPP所逆轉。由于趨化因子在RA的發病機制中發揮重要作用，因此，上述結果提示通過調節滑膜細胞分泌趨化因子可能是辛伐他汀有效治療RA的重要機制之一。因為HMG-CoA途徑產物MEVA和GGPP均能逆轉辛伐他汀對類風濕關節炎FLS分泌趨化因子的抑制作用，提示辛伐他汀可能通過干擾細胞體內異戊二烯化過程參與調控趨化因子分泌。

RhoA蛋白屬于小分子GTP酶，具有多種生物學功能，不僅能調節細胞遷移、增殖、凋亡，而且在調控免疫反應方面亦有重要作用［15］。對單核細胞、內皮細胞等多種細胞系研究發現，Rho蛋白是促炎因子產生的重要調節因子［16，17］。在 RA滑膜細胞中，RhoA也介導凝血酶(thrombin)誘導的細胞增殖和IL-6分泌［18］。本研究發現，TNF-α能促進RhoA活化，而RhoA抑制劑能顯著抑制TNF-α誘導的IL-8和MCP-1分泌，提示RhoA參與調控類風濕關節炎FLS產生趨化因子，在RA發病機制中起重要作用。

近年大量研究表明，他汀類藥物可能通過調控Rho GTP酶活性參與調節炎癥和免疫反應［13］。在RA滑膜細胞中，辛伐他汀通過調控RhoA活性抑制重要炎癥轉錄因子NF-κB活化和IL-1、IL-6等促炎細胞因子分泌［19］。本研究發現，辛伐他汀不僅對TNF-α誘導的IL-8、MCP-1等有抑制作用，而且對RhoA活化也有顯著的抑制作用，提示辛伐他汀可能通過抑制RhoA活化調控類風濕關節炎FLS分泌趨化因子。

為了解辛伐他汀和RhoA抑制劑C3轉化酶對類風濕關節炎FLS分泌趨化因子的抑制作用是否與其細胞毒作用有關，我們分別用辛伐他汀(1 μmol/L)和C3轉移酶(20 mg/L)與類風濕關節炎FLS孵育，發現與對照組比較，辛伐他汀和C3轉化酶對細胞活性的影響無顯著差異，提示在本實驗所用濃度范圍內辛伐他汀和C3轉移酶抑制細胞趨化因子分泌與其細胞毒作用無關。

總之，本研究發現在RA中辛伐他汀通過調節RhoA信號通路活性抑制TNF-α誘導的FLS分泌IL-8和MCP-1等趨化因子，提示抑制滑膜細胞趨化因子分泌可能是辛伐他汀在RA中發揮作用的機制之一，RhoA也可能是RA潛在的一個治療靶點。

［1］陳瑞林，陶 怡，黃文輝.類風濕關節炎CD4+CD28-T細胞與淋巴細胞凋亡的相關性研究［J］.中國病理生理雜志，2010，26(9):1824-1827.

［2］Koch AE.Chemokines and their receptors in rheumatoid arthritis:future targets?［J］.Arthritis Rheum，2005，52(3):710-721.

［3］Haringman JJ，Smeets TJ，Reinders-Blankert P，et al.Chemokine and chemokine receptor expression in paired peripheral blood mononuclear cells and synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis，osteoarthritis，and reactive arthritis［J］.Ann Rheum Dis ，2006，65(3):294-300.

［4］Sch?nbeck U，Libby P.Inflammation，immunity，and HMG-CoA reductase inhibitors statins as anti-inflammatory agents?［J］.Circulation，2004，109(21 Suppl):II18-II26.

［5］Ghittoni R，Lazzerini PE，Pasini FL，et al.T lymphocytes as targets of statins:molecular mechanisms and therapeutic perspectives［J］.Inflamm Allergy Drug Targets，2007，6(1):3-16.

［6］Abud-Mendoza C，de la Fuente H，Cuevas-Orta E，et al.Therapy with statins in patients with refractory rheumatic diseases:a preliminary study ［J］.Lupus，2003，12(8):607-611.

［7］McCarey DW，McInnes IB，Madhok R，et al.Trial of atorvastatin in rheumatoid arthritis(TARA):doubleblind，randomised placebo-controlled trial［J］.Lancet，2004，363(9246):2015-2021.

［8］Tikiz C，Utuk O，Pirildar T，et al.Effects of angiotensin-converting enzyme inhibition and statin treatment on inflammatory markers and endothelial functions in patients with long term rheumatoid arthritis ［J］.J Rheumatol，2005，32(11):2095-2010.

［9］Leung BP，Sattar N，Crilly A，et al.A novel anti-inflammatory role for simvastatin in inflammatory arthritis［J］.J Immunol，2003，170(3):1524-1530.

［10］Barsante MM，Roffe E，Yokoro CM，et al.Anti-inflammatory and analgesic effects of atorvastatin in a rat model of adjuvant-induced arthritis［J］.Eur J Pharmacol 2005，516(3):282-289.

［11］Arnett FC，Edworthy SM，Bloch DA，et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，1988，31(3):315-324.

［12］Xu H，He Y，Yang Y，et al.Anti-malarial agent artesunate inhibits TNF-α-induced production of proinflammatory cytokines via inhibition of NF-κB and PI3 kinase/Akt signal pathway in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes［J］.Rheumatology(Oxford)，2007，46(6):920-926.

［13］Ortego M，Bustos B，Heraández-Presa MA，et al.Atorvastatin reduces NF-κB activation and chemokine expression in vascular smooth muscle cells and monocytes［J］.Atherosclerosis，1999，147(2):253-261.

［14］Burridge K，Wennerberg K.Rho and Rac take center stage［J］.Cell，2004，116(2):167-179.

［15］Chen LY，Zuraw BL，Liu FT，et al.IL-1 receptor-associated kinase and low molecular weight GTPase RhoA signal molecules are required for bacterial lipopolysaccharide-induced cytokine gene transcription［J］.J Immunol，2002，169(7):3934-3939.

［16］Hippenstiel S，Soeth S，Kellas K，et al.Rho proteins and the p38-MAPK pathway are important mediators for LPS-induced interleukin-8 expression in human endothelial cells［J］.Blood ，2000，95(10):3044-3051.

［17］Nakayamada S，Kurose H，Saito K，et al.Small GTP-binding protein Rho-mediated signaling promotes proliferation of rheumatoid synovial fibroblasts［J］.Arthritis Res Ther ，2005，7(3):R476-R484.

［18］Xu H，Liu P，Liang L，et al.RhoA-mediated，tumor necrosis factor α -induced activation of NF- κB in rheumatoid synoviocytes:inhibitory effect of simvastatin［J］.Arthritis Rheum ，2006，54(11):3441-3451.