Maxadilan對誘導多能干細胞增殖的作用*

招志毅， 陳建蘇△， 余榕捷， 劉曉飛， 譚美華， 李紅陽

(暨南大學 1附屬第一醫院眼科，醫學院眼科研究所，再生醫學教育部重點實驗室，2生物工程研究所，廣東 廣州 510632)

傳統的干細胞治療在臨床應用上有道德倫理的問題以及免疫排斥反應等缺點。2006年，人誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，IPSCs)的產生讓我們有可能進行病人體細胞來源的干細胞治療，從而避免了道德倫理及免疫排斥等缺點［1］。近年來，雖然IPSCs研究取得較大進展，但仍存在著日常培養、細胞凍存和復蘇過程中IPSCs容易凋亡導致IPSCs數減少，難于培養及擴增的問題［2］。尋找一種藥物作為IPSCs培養液的添加劑來幫助擴增IPSCs將會為我們更好地研究IPSCs打下基礎。

垂體腺苷酸環化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP)是一種神經營養肽。有研究證明PACAP及其I型受體(PAC1受體)特異激動劑maxadilan能促進多種細胞的增生［3，4］。2004 年，Cazillis 等［5］首先發現鼠胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)存在PAC1受體。目前，尚無文獻報道IPSCs是否存在PAC1受體。本實驗首先檢測IPSCs的PAC1受體存在情況，然后利用PAC1受體特異激動劑maxadilan觀察其對IPSCs的效應。

材料和方法

1 主要材料與試劑

UMC-人IPSCs系(中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院惠贈);Maxadilan(暨南大學生物工程研究所余榕捷教授惠贈);mTeSR1培養基(WiCell);兔源性多克隆PAC1受體抗體(Santa Cruz);兔單克隆β-actin抗體(Cell Signaling);山羊抗兔IgG抗體(Santa Cruz);兔抗人OCT4抗體 (Cell Signaling);兔抗人Nanog抗體(Cell Signaling);鼠抗兔IgG抗體(Chemicon);熒光顯微鏡(Leica);CCK-8試劑盒(Donjindo);20%Knockout血清替代品(Gibco);流式細胞儀(BD FACSAriaTM);PTC-100PCR儀(M J research);CFX96實時PCR檢測系統(Bio-Rad);引物合成(Invitrogen);全波長多功能酶標儀(Tecan Safire2，Switzerland)。

2 方法

2.1 IPSCs培養 使用無飼養層細胞的IPSCs培養方式。細胞于mTeSR1培養基37℃、5%CO2培養箱內培養，每天顯微鏡觀察，有分化的克隆及時挑走，每天更換培養液，5-7 d傳代。實驗組為傳代后第4 d培養液中加入不同濃度的maxadilan，孵育24 h。對照組未加入maxadilan。

2.2 胚體培養 取100 nmol/L maxadilan實驗組和對照組的IPSCs進行胚體培養。2組各按5×103/well細胞密度于超低粘附24孔板進行懸浮培養。培養液為:80%DMEM/F12，20%Knockout血清替代品，1 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L β -巰基乙醇和0.1 mmol/L非必需的氨基酸。約14-20 d后形成囊狀胚體。兩組胚體放于ECM包被的6孔板上培養2-3周。

2.3 Western blotting檢測 收集1×106IPSCs裂解后的上清液，進行SDS-PAGE電泳。然后電轉移到PVDF膜上，PVDF膜浸入在5%封閉液，4℃振蕩1h，PVDF膜與兔多克隆PAC1受體抗體(1∶2000)和兔單克隆β-actin抗體(1∶3000)4℃孵育過夜，再與山羊抗兔IgG抗體(1∶3000)室溫孵育1 h，ECL法顯色，顯影劑孵育1 min和定影劑孵育0.5 min。

2.4 CCK-8法檢測 IPSCs按5×103/well的細胞密度96孔板鋪板，孵育24 h后加入不同濃度的maxadilan，繼續孵育24 h。每個孔中加入10 μL CCK-8溶液，培養2 h，用多功能酶標儀測定各孔在波長450 nm的吸光度值(A)。實驗重復3次。

2.5 流式細胞儀檢測 3×105/well細胞密度接種于6孔板，實驗組、對照組細胞用0.05%胰蛋白酶消化10 min，收集細胞，70%乙醇吹散制備成單細胞懸液，碘化丙啶染色，流式細胞儀分析細胞周期。實驗重復3次。

2.6 核型檢測 取已傳3代100 nmol/L maxadilan實驗組和對照組的細胞做染色體核型分析。簡言之，用0.05 g/L秋水仙胺37℃孵育細胞150 min，0.05%胰蛋白酶消化10 min，重懸，用3∶1甲醇冰醋酸固定3次，滴于載玻片上55℃過夜，0.05%胰蛋白酶處理30 s后Giemsa液染色。

2.7 逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)以及實時定量PCR(real-time qPCR)檢測 各收集1×106未做挑分化克隆處理并已傳3代的100 nmol/L maxadilan實驗組和對照組細胞，real-time qPCR檢測多能性基因OCT4、Nanog以及神經分化標志基因 Nestin、PAX6。收集100 nmol/L maxadilan實驗組和對照組2組胚體所形成的各種細胞，RT-PCR檢測外胚層標志基因SOX1、PAX6和Nestin，中胚層標志基因GATA4和PPAR，內胚層標志基因FOXA2和SOX17。定量PCR檢測2組胚體形成的各種細胞的Nestin和PAX6基因含量。簡言之，Trizol法提取2組細胞總RNA，各取1 μL RNA檢測 RNA 純度和完整性;2 μL總RNA 在 20 μL 含有 4 μL 5 ×reverse transcriptase buffer ，2 μL dNTPs，1 μL RNase inhibitor ，1 μL Oligo(dT)，1 μL AMV reverse，9 μL DEPC H2O 反應液中合成cDNA;以GAPDH作為內參照。PCR引物序列見表1。RT-PCR檢測時，在PTC-100PCR儀以上進行擴增、循環，PCR電泳產物照相。定量PCR檢測時，在CFX96實時PCR檢測系統上行定量PCR檢測。25 μL 反應體系，包括 12.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(2 × )，2 μL DNA 模板，0.5 μL 上、下游引物(10μmol/L)及 9.5 μL dH2O。反應條件為:95℃ 30 s預變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環擴增后獲得兩組 Ct值，繪制標準曲線，用基于ΔΔCt的方法進行相對定量分析［6］。實驗重復3次。

表1 PCR引物序列Table 1.PCR primer sequences

2.8 免疫熒光法檢測 100 nmol/L maxadilan實驗組和對照組細胞未做挑分化克隆處理并傳3代，于傳代后第5 d行免疫熒光法檢測多能性標志蛋白OCT4和Nanog。除行細胞爬片免疫熒光顯微鏡法觀察OCT4和Nanog表達、拍照外，各收集1×106細胞行多功能酶標儀定量檢測OCT4和Nanog蛋白的熒光A值。簡言之，在4%多聚甲醛固定30 min后，0.3%Triton-X-100室溫下透化處理15 min，10%胎牛血清封閉60 min，兔抗人 OCT4抗體、兔抗人Nanog抗體孵育過夜，鼠抗兔IgG抗體孵育60 min，DAPI染色液室溫作用15 min，或用甘油封片、熒光顯微鏡觀察拍照或用全波長多功能酶標儀在激發光波長為495 nm、發射光波長為520 nm下檢測熒光A值。實驗重復3次。

3 統計學處理

結 果

1 RT－PCR和Western blotting分析IPSCs的PAC1受體

RT-PCR結果顯示，IPSCs的PAC1受體mRNA表達陽性，見圖1A。Western blotting結果顯示IPSCs表達PAC1受體和它的亞型或二聚體，見圖1B。

Figure 1.Expression of PAC1 mRNA in IPSCs analyzed by RT-PCR(A)and PAC1 and its isoforms or their dimmers present in IPSCs identified by Western blotting(B).M:marker圖1 IPSCs的PAC1受體mRNA和蛋白表達

2 CCK－8法檢測

圖2顯示，100 nmol/L maxadilan明顯促進IPSCs增殖，100 nmol/L maxadila組比對照組細胞增多16%，差異顯著(P＜0.05)。

Figure 2.Effects of in various concentrations of maxadilan on the viability of IPSCs detected by CCK-8 assay..n=12.*P＜0.05 vs control.圖2 不同濃度的maxadilan對IPSCs增殖的影響

3 細胞周期分析

細胞增殖指數(proliferation index，PI)是指處于G2/M期和S期的細胞占全部細胞的百分數，即PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。圖3和圖4顯示，經100 nmol/L maxadilan處理3 h、6 h和9 h的IPSCs的PI平均值為47.23%、59.70%和55.67%，與對照組37.00%相比，差異顯著(P＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.01)。這表明經過 maxadilan處理的IPSCs處于增殖期的細胞增多。

4 染色體核型分析

圖5顯示，實驗組和對照組均有著正常的46XX女性染色體核型。

5 RT－PCR和real－time qPCR分析

5.1 未做挑分化克隆處理并傳3代的對照組和100 nmol/L maxadilan實驗組的 Nanog、OCT4、Nestin 和PAX6基因表達均為陽性，其中2組的Nanog、OCT4、PAX6、Nestin等基因表達量比較無顯著差異(P＞0.05)，見圖6。

5.2 對照組和100 nmol/L maxadilan實驗組形成的胚體細胞的 PAX6、SOX1、PPAR、GATA4、FOXA2、SOX17和Nestin基因表達陽性。其中PAX6和Nestin基因表達量兩組間比較無顯著差異(P＞0.05)，見圖7。

6 免疫熒光法分析

6.1 對照組和100 nmol/L maxadilan實驗組IPSCs均保持著典型的未分化的干細胞外形，其多能性標志蛋白Nanog和OCT4熒光著色，見圖8。

6.2 對照組和100 nmol/L maxadilan實驗組多能性標志蛋白Nanog和OCT4熒光A值比較未見顯著差異(P ＞0.05)，見圖9。

Figure 3.Effects of 100 nmol/L maxadilan on cell cycle of IPSCs at various time points using flow cytometric analysis.A:control group;B:IPSCs with 100 nmol/L maxadilan treatment for 3 h group;C:IPSCs with 100 nmol/L maxadilan treatment for 6 h group;D:IPSCs with 100 nmol/L maxadilan treatment for 9 h group.圖3 不同時點100 nmol/L maxadilan對IPSCs細胞周期的影響

Figure 4.Effects of 100 nmol/L maxadilan on proliferation index of IPSCs at various time points using flow cytometric analysis..n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖4 不同時點100 nmol/L maxadilan對IPSCs增殖指數的影響

Figure 5.Karyotype analysis was performed in control group(A)and 100 nmol/L maxadilan treatment group(B).Pictures show normal karyotype in both groups.圖5 實驗組和對照組染色體核型分析

Figure 6.RT-PCR analysis of Nanog，OCT4，PAX6 and Nestin mRNA expression in control group(a)and 100 nmol/L maxadilan treatment group(b)..n=3.圖6 對照組和 maxadilan實驗組 Nanog、OCT4、PAX6和Nestin mRNA表達

討 論

Figure 7.RT-PCR analysis of PAX6，SOX1，PPAR，GATA4，FOXA2，SOX17 and Nestin mRNA expression in the EBs from control group(a)and from 100 nmol/L maxadilan treatment group(b)..n=3.圖7 對照組和maxadilan實驗組形成的胚體細胞PAX6、SOX1、PPAR、GATA4、FOXA2、SOX17 和 Nestin mRNA表達

傳統的干細胞治療在臨床應用上有道德倫理的問題以及免疫排斥反應等缺點。2006年，科學家Yamanaka等［1］成功地使鼠成纖維細胞重編為類似胚胎樣的IPSCs。IPSCs的產生讓我們有可能進行病人自體細胞來源的干細胞治療，從而避免了道德倫理及免疫排斥等缺點。2006年后，IPSCs研究逐漸成為各醫學領域研究熱點并且取得較大進展。不過，盡管IPSCs培養技術有了較大進步，但培養、傳代、復蘇、凍存過程中IPSCs容易凋亡導致IPSCs數減少，不利于培養擴增這問題未能較好解決［2］。尋找一種藥物作為IPSCs培養液的添加劑來幫助擴增IPSCs數將會為我們更好地研究IPSCs打下基礎。

Figure 8.Protein expression of Nanog and OCT4 in control group and 100 nmol/L maxadilan treatment group(×40).A:control group，Nanog staining;B:control group，DAPI staining;C:maxadilan treatment group，Nanog staining;D:maxadilan treatment group，DAPI staining;E:control group，OCT4 staining;F:control group，DAPI staining;G:maxadilan treatment group，OCT4 staining;H:maxadilan treatment group，DAPI staining.圖8 實驗組和對照組Nanog和OCT4蛋白表達

Figure 9.Protein expression of Nanog(A)and OCT4(B)in control group and 100 nmol/L maxadilan treatment group..n=9.圖9 對照組和maxadilan實驗組多能性標志蛋白Nanog和OCT4表達

PACAP是一種神經營養肽，屬于血管活性腸肽/胰泌素/胰高血糖素家族，有 PAC1、VPAC1和VPAC23 種受體［3］。2004 年，Cazillis等［5］首先利用RT-PCR發現ESCs存在有PACAP的PAC1受體，其PAC1受體是hop、hip和hiphop等PAC1受體亞型;并發現PACAP通過PAC1受體促使ESCs往神經元方向分化。2005年，Hirose等［7］發現在未分化的ESCs中含有PAC1受體;并發現在ESCs定向分化為神經元時，PAC1受體mRNA表達上調;而在ESCs向神經膠質分化時，PAC1受體的mRNA表達顯著降低。Chafai等［8］利用電生理膜片鉗技術發現PACAP通過鼠ESCs的PAC1受體和VPAC2受體促使分化的ESCs產生生物電活動。目前，IPSCs是否存在PACAP的PAC1受體未見文獻報道。在本實驗中，我們利用RT-PCR和Western blotting證實IPSCs表達PAC1受體基因和蛋白。

目前，有研究證明PACAP及其PAC1受體特異激動劑 maxadilan 能促進多種細胞的增殖［3，4］，但尚無通過PACAP或maxadilan促進ESCs增殖的文獻報道。本實驗中，我們通過在IPSCs培養液中加入maxadilan，觀察maxadilan對IPSCs的影響。結果發現100 nmol/L maxadilan明顯促進IPSCs增殖。細胞周期分析顯示加入100nmol/L maxadilan后IPSCs增殖指數顯著增加并以maxadilan作用6 h后效果最為明顯。表明經過maxadilan處理6 h后IPSCs處于增殖期的細胞最多。這些資料均顯示maxadilan可以促進IPSCs增殖。

PACAP是一種神經營養肽。Cazillis等［5］認為PACAP通過PAC1受體可以誘導ESCs分化為神經元。Scharf等［9］認為PACAP具有下調神經干細胞分化的功能。Maxadilan是否會引起IPSCs往神經細胞方面分化是我們關心的問題。Nestin和PAX6是神經祖細胞、神經外胚層以及神經嵴干細胞標志，是檢測神經分化的指標［10］。在本實驗中，我們觀察到無論是100 nmol/L maxadilan實驗組IPSCs還是100 nmol/L maxadilan實驗組IPSCs形成的胚體細胞，其細胞的Nestin和PAX6基因表達量均與對照組相比未見明顯差異(P＞0.05)。而100 nmol/L maxadilan實驗組和對照組的干細胞標志Nanog和OCT4無論從基因表達量還是從蛋白含量比較均未見明顯差異(P＞0.05);2組的Nanog和OCT4免疫熒光染色均呈現典型的未分化干細胞外形。這些資料證明:至少在我們所使用的劑量水平上，maxadilan沒有對IPSCs分化產生影響和沒有促使IPSCs往神經方向分化。而從100 nmol/L maxadilan實驗組染色體核型分析以及胚體分化為三胚層能力上看亦未見max-adilan對IPSCs產生影響。

目前，研究發現PACAP通過3種途徑誘導細胞增殖。(1)環單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)途徑。Hashimoto等［11］在研究 PACAP誘導星形細胞增殖機制時發現利用cAMP拮抗物Rp-cAMP可以阻斷PACAP刺激細胞增殖作用。(2)蛋白激酶C途徑。Mercer等［12］研究發現蛋白激酶C抑制劑可以完全抑制PACAP引起的神經干細胞的增殖。(3)磷脂酶C途徑。Nicot等［13］發現PACAP可以通過激活磷脂酶C后增加細胞內鈣離子達到促細胞增殖作用。

在本實驗中，我們首次發現IPSCs存在PACAP的PAC1受體，并證明PAC1受體特異激動劑maxadilan可對IPSCs發揮促增殖作用且不影響IPSCs的多能性和染色體核型。研究maxadilan促進IPSCs增殖的機制將是我們下一步的任務。

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