酸洗脫血小板HLA－Ⅰ類抗原的研究*

劉相富， 鄒 勇， 劉文達， 陸 英， 覃雪玲， 李 芳，廖思紅， 袁 青， 劉貴蓮， 林哲生， 黎結芳， 林東軍，2△

(中山大學附屬第三醫院1輸血科，2血液科，廣東 廣州 510630)

血小板輸注是預防和治療因血小板減少或血小 板功能缺陷引起出血的主要手段，但隨著血小板制品在臨床的廣泛應用，產生同種免疫的幾率也大大增加，從而導致血小板輸注無效。血小板輸注無效主要以產生人類白細胞抗原－1(human leukocyte antigen－1)HLA－Ⅰ類抗體為主，其次為血小板抗原特異性抗體(human platelet alloantigen，HPA)。病人一旦發生血小板輸注無效將面臨臨床治療和經濟上的雙重困境，因此國內外學者一直在探索預防血小板輸注無效的新方法。目前國內學者已廣泛開展利用多種血小板洗滌液制備洗滌血小板的研究［1，2］。洗滌血小板雖可以有效去除血小板制劑中殘留的白細胞和血漿蛋白，降低了非溶血性發熱反應和過敏反應的發生率，但卻無法阻止血小板輸注無效的發生。血小板表面HLA－Ⅰ類抗原的存在是產生HLA－Ⅰ類抗體、發生血小板輸注無效的主要原因，因此如何能去除血小板表面HLA－I類抗原是制備預防輸注無效血小板的關鍵。在此研究中，我們利用不同pH值(pH=2、3、5、7)的檸檬酸緩沖液對血小板進行酸處理，觀察酸處理對血小板的活化、凋亡及聚集功能的影響。我們的研究發現檸檬酸緩沖液的pH值越低，血小板HLA－I類抗原的洗脫效率越高，但血小板的活化率和凋亡率也越高。利用pH=3的檸檬酸緩沖液0℃洗脫血小板可有效洗脫血小板表面HLA－Ⅰ類抗原，盡管血小板活化率和凋亡率顯著增加，但聚集功能未受顯著影響，因此可用于預防血小板輸注無效。

材料和方法

1 材料

FACSCalibur流式細胞儀(BD);560CA血小板聚集儀(Chrono－Log);CD41a－APC、CD62P－PE和HLA－ABC－FITC鼠抗人單克隆抗體，IgG1－PE和IgG1－FITC鼠抗人同型對照抗體均購自BD;Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物。

2 方法

2.1 標本留取 本研究中的血小板樣本均來自廣州血液中心符合機采血小板捐獻標準的健康獻血者，每人份血小板計數均大于2.5×1011。每次實驗前將22℃振蕩的血小板混勻，分出血小板2－3 mL于相連的樣品袋中，然后進行體外處理。

2.2 不同pH值檸檬酸緩沖液的配置 先配置0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L檸檬酸溶液，而后按照一定體積比分別配置pH=2、3、5、7的檸檬酸緩沖液，pH計滴定微調。

2.3 pH=3的檸檬酸鹽緩沖液處理血小板流程取混勻后的500 μL機采血小板懸液(約含5×108個血小板)，1500 r/min室溫離心10 min后棄上層血漿，加入500 μL含1% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)pH=3的檸檬酸緩沖液冰上孵育10 min，林格式醋酸緩沖液洗滌，PBS重懸，細胞計數。

2.4 血小板活化檢測 各取1×106檸檬酸處理前后及PBS處理后血小板，采用三色流式技術檢測血小板表面HLA－Ⅰ類分子(HLA－AB)及P－選擇素(selectin P，CD62P)的表達。同型對照管加入CD41a－APC、IgG1－PE及IgG1－FITC鼠抗人同型對照抗體;實驗管加入 CD41a－APC、CD62P－PE和HLA－ABC－FITC抗體各20 μL，于室溫閉光孵育30 min后立即上機檢測。

2.5 血小板凋亡檢測 各取1×106檸檬酸處理前后及PBS處理后血小板，用500 mL binding buffer重懸細胞;加入1 μL Annexin V－FITC混勻;室溫避光反應10 min后立即上機檢測。

2.6 血小板功能檢測 處理前、PBS及不同pH值檸檬酸處理后的血小板懸液經全自動血細胞分析儀血小板計數后調整到一致濃度，加入10 μL ADP作誘導劑，終濃度為10 g/L，在560CA型全自動血小板聚集儀(Chrono－log)上進行檢測，記錄最大聚集率(%)。

2.7 多色流式設門及分析 先用前向散射角(forward－scattering angle，FCS)及側向散射角(side scatter，SSC)確定待檢細胞群，然后以FCS和CD41a設門確定血小板(CD41a+)，最后在血小板(CD41a+)中分析其表面HLA－ABC及CD62P的表達百分率，見圖1。

3 統計學處理

應用SPSS 15.0進行統計學分析，數據以均數±標準差()表示，多組間均數的比較用單因素方差分析。

結 果

1 不同pH值檸檬酸處理后血小板HLA－Ⅰ類抗原及CD62P的表達

通過流式分析發現，相對處理前，PBS處理、pH=5和pH=7的檸檬酸緩沖液處理后的血小板表面HLA－Ⅰ類抗原表達均未見顯著減少(均 P＞0.05)，CD62P表達也均未見顯著增加(均 P＞0.05)。而pH=2和pH=3的檸檬酸緩沖液處理后的血小板表面HLA－Ⅰ類抗原表達均顯著減少(P＜0.05)，從處理前98.8% ±1.5%分別減至8.9%±2.1%和20.0% ±7.7%，而CD62P的表達均顯著增加，從處理前9.9% ±4.2%分別增至84.6% ±8.5%和45.6%±7.9%。相對pH=3的檸檬酸緩沖液處理，pH=2的檸檬酸緩沖液處理后血小板HLA－Ⅰ類抗原的清除率更高(P＜0.05)，誘導的CD62P的表達也更顯著(P＜0.05)，見圖2、3。

Figure 1.The schematic of multi－color flow analysis.圖1 多色流式分析示意圖

Figure 2.Expression of platelet HLA class－Ⅰantigens after treatment with the citric acid buffer at different pH leves..n=6.*P＜0.05 vs other groups.圖2 不同pH值檸檬酸緩沖液處理后血小板HLA－Ⅰ類抗原的表達

2 不同PH值檸檬酸緩沖液處理后血小板的凋亡百分比

Figure 3.Expression of P－selectin(CD62P)on platelet after treatment with the citric acid buffer at different pH levels..n=6.*P＜0.05 vs other groups.圖3 不同pH值檸檬酸緩沖液處理后血小板P－選擇素(CD62P)的表達

對不同pH值檸檬酸緩沖液處理后血小板進行Annexin V染色分析，發現相對PBS、pH=5和pH=7的檸檬酸緩沖液處理，pH=2和pH=3的檸檬酸緩沖液處理均顯著增加了血小板的早期凋亡率(均P＜0.05)。與pH=3的檸檬酸緩沖液處理相比，pH=2的檸檬酸緩沖液處理誘導的血小板的早期凋亡率更高(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The proportion of early apoptotic platelets after treatment with the citric acid buffer at different pH levels..n=6.*P＜0.05 vs other groups.圖4 不同pH值檸檬酸緩沖液處理后血小板早期凋亡率

3 pH=3的檸檬酸緩沖液處理對血小板聚集功能的影響

通過血小板聚集儀測定，與處理前相比，PBS和pH=3的檸檬酸緩沖液處理后血小板的聚集率均顯著下降(P＜0.05)。但相對PBS處理，pH=3的檸檬酸緩沖液處理后的血小板其聚集率并未顯著下降(21.2% ±14.3%vs 16.8% ±11.0%，P ＞0.05)，見圖5。

Figure 5.Effect of acid eluting HLA － classⅠantigens with the citric acid buffer at pH=3 on platelet aggregation..n=6.*P ＜0.05 vs other groups.圖5 pH=3的檸檬酸緩沖液處理對血小板聚集功能的影響

討 論

早在1989年，Kurata等［3］就發現利用 pH=3的弱酸緩沖液可以有效去除血小板表面HLA－Ⅰ類抗原，并且處理后的血小板表面糖蛋白GPⅠB和GPⅡb/Ⅲa的抗原性未見改變，血小板活力未見顯著減少，聚集功能僅見輕微下降。采用流式細胞術檢測血小板活化狀態也是很好的方法之一［4］。之后，多位研究者開始了利用酸處理血小板治療同種免疫難治性血小板減少患者的臨床前期探索，也有幾例相關的病例報道［5，6］。然而進入21世紀后，弱酸洗滌血小板這一技術的基礎和臨床研究就毫無進展，也鮮有相關報道。為進一步探討這一酸洗脫技術臨床運用的可行性，我們利用不同pH值(pH=2、3、5、7)的檸檬酸緩沖液對血小板進行酸處理，評價了酸洗脫血小板表面HLA－Ⅰ類抗原對血小板活化、凋亡及其聚集功能的影響。通過研究發現，(1)檸檬酸緩沖液pH值越低，血小板表面HLA－Ⅰ類抗原的洗脫率越高，但同時血小板的活化率和早期凋亡率越高;(2)pH=3的檸檬酸緩沖液洗脫血小板可有效洗脫血小板表面HLA－Ⅰ類抗原，雖然血小板活化率和早期凋亡率顯著增加，但其聚集功能卻未受顯著影響，故利用pH=3的檸檬酸緩沖液0℃洗脫血小板HLA－I類抗原可作為預防血小板輸注無效的方法進行嘗試，其臨床應用的可行性尚待更多的體內外研究來驗證;(3)室溫酸洗脫血小板顯著降低了血小板糖蛋白的穩定性GPⅡb/Ⅲa(結果未顯示)，故酸洗脫應在0℃條件下進行。

酸處理誘導的血小板活化和凋亡是酸洗脫血小板臨床應用的最大障礙。血小板一旦活化，其儲備功能就相應下降，在體內的存活率也相應下降［7－10］。我們當前的研究也證實，利用pH=3的檸檬酸緩沖液洗脫血小板顯著誘導了血小板的活化和凋亡，說明酸處理本身存在血小板的損傷。但盡管如此，與PBS處理相比，pH=3的檸檬酸緩沖液處理后的血小板其聚集功能并未受到顯著影響，說明酸處理后的血小板仍具備一定的體內即刻止血功能，但此產品無法滿足以提高外周血血小板數量為目的的臨床治療需求。因此需要新的酸處理技術，新的血小板激活抑制劑或保護劑的應用來降低酸處理過程中對血小板的激活損傷，從而提高血小板的體內存活率。目前國內已報道將可逆性血小板激活抑制劑應用于血小板保存中的研究。劉景漢等［11］在冷凍干燥保存血小板的實驗研究中利用可逆性血小板激活抑制劑組合(前列腺素E1、左旋精氨酸、植酸鈉和百維利肽等)，降低了凍干血小板的CD62P表達，延長了凍干血小板的生存時間。付涌水等［12］也證實可逆性血小板激活抑制劑一氧化氮可減少體外保存血小板的活化。因此可以想象血小板激活抑制劑同樣可以運用于血小板的酸處理過程中。此外加上全自動血細胞洗滌儀以及新型血小板洗滌液的運用，洗滌過程中血小板的人為激活將減少，相信不久的將來高質量、安全可靠的酸洗脫HLA血小板產品將在臨床治療中發揮重要作用。

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