腎上腺髓質素對內毒素性休克大鼠心肌細胞β－腎上腺素受體激動劑反應性的影響*

張曉暉， 金滿文

(1廣州中醫藥大學深圳附屬醫院中心實驗室，廣州 深圳 518033;2華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院藥理學系，湖北 武漢 430030)

在內毒素血癥中，細菌或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)啟動一系列的細胞內反應，導致心臟收縮效能的降低、左心室功能不全［1］，其機制目前尚不清楚。腎上腺髓質素(adrenomedullin，ADM)是一種多功能的調節肽［2］，在多種不同的病理生理條件下，特別是內毒素性休克時，其循環血液中的水平顯著提高［3］。另外在心臟組織中已檢測到ADM mRNA的表達、ADM免疫活性及其豐富的結合部位，ADM已被看成是調節心臟功能的自分泌或旁分泌因子［4］。我們用高劑量ADM長時間孵育正常心室肌細胞來模擬內毒素血癥時的過度產生，并以細胞縮短為指標，研究內毒素癥休克對心肌收縮的影響及ADM在其中的作用。

β－腎上腺素受體信號系統是介導心肌收縮的主要通路之一。該系統主要包括β－腎上腺素受體、G－蛋白、腺苷酸環化酶(adenyl cyclase，AC)、蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)和收縮結構的組成元素。內毒素性休克時，循環血液中增加的ADM可減少人心肌細胞縮短速率，并鈍化β－腎上腺素受體介導的心肌細胞縮短速率的增加［5］。此外，心肌細胞對β－腎上腺素受體刺激的正性變力反應與細胞內cAMP的增加相關聯。因此，我們以細胞內cAMP的水平為指標，探討ADM對內毒素性休克大鼠β－腎上腺素受體信號系統的影響。

材料和方法

1 動物和試劑

健康雄性SD大鼠，10－15周齡，體重250－300 g，由同濟醫學院實驗動物中心提供。人ADM和ADM－(22－52)購于 Peninsula Laboratories。LPS(Escherichia coli serotype 0111∶B4)、牛血清白蛋白、XIV型蛋白酶、異丙腎上腺素(isoprenaline，Iso)、forskolin(FKN)、3－異丁基 －1－甲基黃嘌呤(3－isobutyl－1－methylxanthine，IBMX)和其它化學試劑購于Sigma－Aldrich。Ⅱ型膠原酶為Worthington產品。

2 內毒素性休克動物模型

參照文獻［6］方法，大鼠腹腔內注射LPS(10mg/kg，ip)誘導內毒素血癥。LPS處理4 h后，出現豎毛、淡漠、腹瀉等內毒素血癥體征的清醒大鼠被用于實驗。大約10%動物不出現上述體征，即LPS抵抗的大鼠，則從實驗中剔除。正常對照組動物注射生理鹽水(1 mL/kg，ip)。后續實驗中不再用LPS處理心肌細胞。

3 細胞分離程序

單個心室肌細胞參照文獻［6］所述的酶解法分離。斷頸處死動物，迅速開胸，取出心臟并固定于Langendorff裝置上。使用37℃氧飽和的蒂羅德液灌流心臟冠脈系統5 min后，再用無鈣蒂羅德液灌流5 min，然后用含有1.75 g/L II型膠原酶，1 g/L小牛血清白蛋白和0.28 g/L XIV型蛋白酶的無鈣蒂羅德液灌流20－30 min。取下變軟的心臟，輕輕吹打，使心肌細胞懸浮于高K+溶液(mmol/L):10 KCl，120谷氨酸鉀，10 KH2PO4，1.8 MgSO4，10 ?；撬?，10 HEPES，0.5 EGTA，20葡萄糖，10甘露醇，用KOH調pH值至7.3。實驗前將分離的心肌細胞于室溫下放置至少1 h。

4 測定心肌細胞收縮

心室肌細胞收縮指標通過一個視頻邊緣檢測系統(Ion-Optix)測定，在60 Hz頻率下對細胞長度進行采樣。簡單地說，就是將細胞放置于浴槽，后者固定于倒置顯微鏡(Nikon)下。用鉑電極以20%閾上刺激、0.2 Hz的頻率對細胞進行場刺激(Model S88，Grass)。心肌細胞經顯微鏡附帶的照相系統(IonOptix MyoCam)顯示于計算機的顯示屏上。SoftEdge Acquisition軟件(IonOptix)捕捉并將細胞長度轉化成為數字信號。IonWizard分析軟件 (IonOptix)分析這些數字信號以獲得細胞收縮的指標。最大細胞縮短程度用靜息細胞長度的百分比表示。實驗在室溫(22－24℃)下進行。

5 細胞內cAMP含量的測量

上述分離的心肌細胞懸浮于20 mL臺式液。調整心肌細胞數至6×107/L緩沖液，并置于聚丙乙烯管。在顯微鏡下觀察，細胞懸液中呈桿狀的心肌細胞，即有活力的心肌細胞占60% －70%。心肌細胞預先用100 μmol/L IBMX在37℃孵育15 min，防止cAMP降解。加入100 nmol/L ADM－(22－52)孵育30 min。然后分別加入1 μmol/L Iso處理細胞3 min或1 μmol/L FKN處理細胞5 min。

4℃離心收集細胞，PBS洗滌細胞3次，棄上清。加0.05 mol/L HCl，并放置于沸水中煮3 min。冷卻并冷凍干燥，凍存于－80℃冰箱備用。按cAMP試劑盒(cyclic AMP EIA kit，Bio－medical Technologies)說明，用ELISA的方法測量心肌細胞內cAMP含量。在分光光度計(ImmunoReader NJ2001，Japan Inter Med)410 nm處讀取吸光度值。每孔測量3次。Bradford技術(Bio－Rad protein assay)進行樣本蛋白定量，實驗結果用nmol/g蛋白表示。

6 實驗分組

(1)對照(control)組:正常心肌細胞;(2)LPS處理組:自內毒素休克大鼠分離得到的休克心肌細胞;(3)LPS+ADM－(22－52)組:用100 nmol/L ADM－(22－52)處理休克心肌細胞30 min;(4)control+ADM 60 min組:用100 nmol/L ADM孵育正常心肌細胞60 min;(5)control+ADM 60 min+ADM－(22－52)30 min組:用100 nmol/L ADM孵育正常心肌細胞60 min，后用100 nmol/L ADM－(22－52)處理心肌細胞30 min。

7 統計學處理

結 果

1 內毒素休克對大鼠心肌細胞收縮的影響

圖1顯示內毒素休克大鼠模型的心肌細胞縮短程度較正常對照組心肌細胞明顯減弱(P＜0.01)。100 nmol/L ADM－(22－52)與休克心肌細胞孵育30 min，細胞縮短程度可完全恢復，與休克心肌細胞比，顯著差異(P＜0.01)，與正常對照細胞比較，無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 1.The effects of LPS and ADM on rat myocardial cell shortening ＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs LPS group.圖1 LPS及ADM對大鼠心肌細胞縮短的影響

2 ADM對正常大鼠心肌細胞收縮的影響

如圖2所示，100 nmol/L ADM與正常心肌細胞孵育時間超過60 min時，細胞縮短程度比正常細胞明顯減弱(P＜0.01)。100 nmol/L ADM－(22－52)繼續孵育心肌細胞30 min，細胞縮短程度可完全恢復。

3 腎上腺髓質素對內毒素休克大鼠心肌細胞β－腎上腺素受體激動劑反應性的影響

如圖3所示，內毒素休克心肌細胞 cAMP基礎水平［(10.95±3.20)nmol/g protein，n=8］較正常心肌細胞［(15.74 ±3.32)nmol/g protein，n=7，P ＜0.05］降低。休克細胞經100 nmol/L ADM－(22－52)孵育30 min后，其基礎水平cAMP恢復至正常水平(n=6，P＞0.05)。

經磷酸二酯酶抑制劑IBMX處理后，正常心肌細胞、內毒素休克心肌細胞和ADM－(22－52)處理的休克心肌細胞的cAMP水平與前面結果相似，提示 IBMX處理對基礎水平cAMP影響不大。

如圖3顯示，1 μmol/L Iso誘導正常心肌細胞cAMP增加至(56.40±7.74)nmol/g protein(n=7);誘導休克心肌細胞cAMP增加至(40.35±5.23)nmol/g protein(n=8)，明顯較正常心肌細胞減弱(P＜0.01);ADM－(22－52)處理的休克心肌細胞cAMP水平增加至(52.45±9.23)nmol/g protein(n=6)，與相應休克心肌細胞比較差異顯著(P＜0.05);與相應正常心肌細胞比較無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 2.The effect of ADM treatment for 60 min on rat myocardial cell shortening.*P＜0.05 vs control group.圖2 ADM孵育60 min對正常大鼠心肌細胞縮短的影響

Figure 3.The effect of ADM on β － adrenergic responsiveness in cardio myocytes of septic shock rats..*P＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs corresponding control group;#P＜0.05，##P ＜0.01 vs corresponding LPS group.圖3 ADM對內毒素性休克大鼠心肌細胞β－腎上腺素受體激動劑反應性的影響

1 μmol/L FKN誘導正常心肌細胞cAMP增加至(95.29±7.06)nmol/g protein(n=8)，使休克心肌細胞cAMP增加至(87.29±8.00)nmol/g protein(n=6)，使ADM－(22－52)處理的休克心肌細胞cAMP水平則增加至(91.22±8.55)nmol/g protein(n=6)，3組之間無顯著差異(P＞0.05)。

討 論

本研究觀察到，休克心肌細胞縮短程度較正常心肌細胞明顯減弱，提示內毒素體克影響了心肌細胞的收縮功能，這與以前小鼠、家兔和豚鼠的研究結果一致［7－9］。

特異性的ADM受體拮抗ADM－(22－52)可使減弱的休克心肌細胞收縮恢復正常，提示ADM在內毒素性休克心功能不全中具有重要作用。由于ADM在內毒素性休克中大量產生，我們用高劑量的ADM孵育正常心肌細胞，若正常心肌細胞與ADM孵育時間超過60 min，則表現出明顯的負性肌力作用;特異性的ADM受體拮抗ADM－(22－52)可取消以上負性肌力作用。這說明ADM可直接抑制心肌細胞收縮。有學者在家兔心室肌細胞上也觀察到了ADM的負性變力作用，它還同時減?。跜a2+］i和L型鈣電流，并發現這些作用部分經由左旋精氨酸－NO途徑介導［10］。

β－腎上腺素受體信號系統是介導心肌收縮的主要通路之一。在研究中，與正常對照組比較，用Iso刺激內毒素性休克大鼠的β－腎上腺素受體，cAMP的增加明顯減少。Forskolin(一種直接的AC激動劑)增加cAMP的作用在兩組間沒有變化。以上結果說明內毒素性休克大鼠心肌細胞對β－腎上腺素受體刺激反應性的缺陷存在于AC水平之前，有可能在β－腎上腺素受體與AC之間，或是出現β－腎上腺素受體下調，內毒素性休克并不影響AC的水平或功能。這與早前的研究結果類似。Risφe等［11］發現，內毒素性休克大鼠心臟7型AC的mRNA表達減少，而4型AC的mRNA表達是增加的，另外兩種5型和7型AC的mRNA表達在對照和模型組之間沒有差異，因而總體mRNA水平不變。Matsuda等［12］發現，內毒素性休克的家兔β－腎上腺素受體密度與正常組比較沒有變化，而 Gsα蛋白和GsαmRNA的表達卻減少了50%。

本研究發現特異性的ADM受體拮抗劑ADM－(22－52)可恢復內毒素性休克時心肌細胞對β－腎上腺素受體激動劑的反應性降低，說明內毒素性休克時過量產生的ADM使大鼠心肌細胞收縮減弱，有可能是因為ADM使大鼠心肌細胞對β－腎上腺素受體刺激的反應性降低。人心臟衰竭的特征之一是對β－腎上腺素受體刺激的變力反應性減弱，這種變化通常都歸因于β－腎上腺素受體下調［13］和(或)G蛋白的改變［14］。近來的研究提示NO產生增加可能是引起衰竭心臟β－腎上腺素受體低反應性的另一機制［15］。ADM可刺激多種細胞NO產生增加或iNOS表達增加［16］。ADM是否通過后二者的增加影響內毒素性休克大鼠β－腎上腺素能受體信號系統的反應性還有待進一步研究。

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