微管相關蛋白2、巢蛋白與人胚胎食管肌層發育的關系*

張 泳， 劉學紅

(紹興文理學院醫學院1醫學實驗中心，2組織學與胚胎學教研室，浙江 紹興 312000)

胚胎時期，食管肌層的分化、生長發育受到各種基因的調控，蛋白是基因的表達產物，相應蛋白在組織細胞的表達分布規律能反映基因的活動規律。巢蛋白(nestin)和微管相關蛋白2(microtubule－associated protein 2，MAP－2)均屬于細胞骨架蛋白，其表達分布規律反映細胞的分化、生長發育及增殖能力。目前微管相關蛋白和巢蛋白在動物和人中樞神經系統組織中的分布及病理作用機制研究較多［1－5］，但關于它們在人胚胎食管肌層發育過程中的表達、分布規律及作用機制，目前未見文獻報道。本文通過研究人胚胎食管肌層生長發育過程中微管相關蛋白和巢蛋白表達、分布規律，探討兩者在食管肌層分化、發育過程中的作用，為先天性食管畸形研究提供形態結構基礎和理論依據。

材料和方法

1 胚胎收集與分組

收集發育正常但因意外原因造成人工流產的人胚胎標本16例(每例標本均取得產婦本人同意)。根據產婦末次月經、B超所測胎兒雙頂徑和人胚胎形態學特征等確定胎齡為7－16周。以每4周為1月齡組，每月齡為一研究組，其例數分布如下:第2月齡組5例，第3月齡組6例，第4月齡5例。

2 取材和免疫組織化學染色程序

從胎尸內取出食管標本，分別從每例標本中切取食管長約0.4 cm，用4℃生理鹽水沖洗管腔，放入10%中性甲醛水溶液中固定8－12 h后取出，流水沖洗30 min，行常規脫水、透明、浸蠟和包埋。石蠟切片，片厚4 μm，每個標本取4片，行免疫組織化學染色(所用試劑MAP－2和nestinⅠ抗(小鼠抗人)及其輔助試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司)。免疫組化染色采用PV法:即切片常規脫蠟至水→微波抗原修復→3%H2O2滅活內源性酶→滴加Ⅰ抗(抗體濃度為1∶150)→PV6002→DAB顯色(在以上各步之間均用PBS洗滌5分鐘×3次)→蘇木精輕度復染，然后脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

3 對照實驗

用PBS替代Ⅰ抗、Ⅱ抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。

結 果

切片經染色后，MAP－2和nestin陽性細胞的細胞質/膜呈淡黃色、黃色或深黃色，細胞核不著色。第2月胚齡時，人胚食管肌層薄，內環肌層僅有2－4層肌細胞構成，細胞排列松散，肌間神經叢明顯，內有許多細胞體呈圓形或橢圓形的神經細胞，細胞核大而圓，細胞質少。第3月胎齡時，食管肌層明顯增厚，內環肌層細胞層數增多達5－8層，細胞間排列仍較松散。肌間神經叢增大，神經叢內細胞增多。第4月胎齡時，食管肌層增厚不明顯，但肌細胞間排列較致密，肌間神經叢與第3月相似。

1 Nestin在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層的表達

第2月齡段，nestin蛋白在肌層肌細胞處呈廣泛陽性表達，見圖1A、B;第3月齡段，nestin蛋白在肌層肌細胞處呈廣泛強陽性表達，見圖1C;第4月齡段，nestin蛋白在肌層陽性表達明顯減弱，大部分肌細胞呈陰性表達，見圖1D。第2－4月，nestin蛋白在肌間神經叢內部分神經細胞呈陽性表達，隨著胎齡的增大，陽性表達無明顯變化，見圖1A－D。

Figure 1.At the second to fourth month of gestation，nestin positive expression(↑)in esophageal muscular layer of human embryos(A:×100;B，C，D:×400).A，B:the second month;C:the third month;D:the fourth month.圖1 在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層nestin的陽性表達情況

2 MAP－2在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層的表達

第2－4月齡段，MAP－2在人胚胎食管肌層肌細胞處均呈陰性表達，而在肌間神經叢內神經細胞及神經纖維處呈陽性或強陽性表達，其陽性表達強度隨胎齡增大而增強，見圖2 A－D。

Figure 2.At the second to fourth month of gestation，MAP－2 postive expression(↑)in esophageal muscular layer of human embryos(A，C，D:×400，B:×40).A:the second month;B，C:the third month;D:the fourth month.圖2 在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層MAP－2的陽性表達情況

討 論

巢蛋白為第Ⅵ類中間絲蛋白，和細胞骨架、細胞信號、器官發生、細胞新陳代謝有關，并且代表干細胞增殖、遷移 、分化的特性。它還參與定位和運行亞細胞器，并用來調節骨架蛋白等功能多樣的細胞增殖、生存和分化［6］。現有研究表明［7－10］，巢蛋白廣泛表達于哺乳動物和人的神經系統、胰腺、肌組織等多組織、器官。本實驗結果顯示，第2－3月胎齡段的人胚胎食管肌層細胞內呈陽性表達，第4月齡大部分肌細胞呈陰性表達。說明在胚胎發育的早期階段，食管肌層肌細胞在第4月齡前尚處于生長發育的不成熟期，在大部分肌細胞的細胞質內大量合成細胞骨架成分，促進肌細胞的快速增殖、生長發育，向肌細胞成熟方向發展，以適應胚胎食管隨胎齡增大而增厚的需要。到了第4月齡，食管肌層大部分肌細胞發育接近成熟，細胞骨架成分基本發育完善，肌細胞也由活躍的增殖期逐漸轉為靜止期，細胞增殖能力下降，nestin表達減弱或消失。這與巢蛋白的生物學特性有關，即巢蛋白在干細胞中的表達通常為一過性，當組織分化成熟時，巢蛋白的表達即消失。我們的研究結果與Su等［10］報道nestin在大鼠食管肌層的表達基本一致。更有趣的是我們觀察到nestin在第2－4月齡食管肌間神經叢內部分神經細胞呈陽性表達，隨著胎齡的增大，陽性表達無明顯變化。結果提示第2－4月齡食管肌間神經叢內均存在部分神經前體細胞，這些細胞在隨胎齡的變化而不斷增殖分化，以彌補在發育過程中凋亡的神經細胞或神經膠質細胞。這與Park等［11］報道敲除nestin的小鼠胚胎神經管神經上皮細胞出現大量凋亡，再生能力明顯下降相一致。結合我們前期研究結果，早期食管發育階段，食管肌間神經叢內存在一定數量神經細胞或神經膠質細胞的凋亡，說明在早期胚胎食管發育階段，nestin與食管肌間神經叢內神經前體細胞的生存和再生相關。

MAP－2是一種高度保守的蛋白，是微管組裝的啟動子，作為細胞骨架系統重要成分之一，大量地存在于神經元的胞體和樹突中，其能促進微管形成、誘導微管成束、防止微管解聚，在神經元的生長和發育、突起的形成和生長、軸突和樹突的細胞器運輸及傳遞信號等方面起到重要作用，是神經元特異性標記物之一。錢軍等［12］通過實驗證實MAP2的高表達可能在脊髓損傷后突觸結構的重建及受損神經功能代償和修復中發揮重要作用。我們的實驗結果顯示第2－4月齡段，MAP－2在人胚胎食管肌層肌細胞處均呈陰性表達，而在肌間神經叢內神經細胞及神經纖維處呈陽性或強陽性表達，其陽性表達強度隨胎齡增大而增強。結果提示在第2月齡人胚胎食管肌間神經叢內神經前體細胞大部分已分化發育成神經元或神經膠質細胞，但它們尚處于發育早期階段，細胞比較幼稚，各種細胞器尚未發育成熟，細胞骨架蛋白合成能力有限。隨著胎齡的增大，肌層細胞層數增多，肌層增厚，肌間神經叢內神經元和神經膠質細胞細胞器發育逐漸完善，細胞合成微管蛋白能力增強，細胞增殖活躍，為適應食管肌層生長發育需要，食管肌間神經叢內細胞釋放較多的信號，調控遠離的肌細胞生長發育。

因此，我們認為在人胚胎早期生長發育過程中，MAP－2和nestin可能參與了調控食管肌層肌細胞和神經叢內神經細胞的分化、發育。

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